一种用于检测大田软海绵酸的生物传感器及制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及一种用于检测贝类毒素大田软海绵酸的生物传感器及制备方法。
【背景技术】
[0002]大田软海绵酸(okadaic acid，0A)，一种小分子海洋聚醚类毒素，是分布最广、发病率最高的海洋毒素之一，常蓄积于贝类等海洋生物体内，可经食物链引发多种以腹泻为主要特征的食物中毒，能导致严重的胃肠功能紊乱，中毒症状极易与细菌性胃肠炎混淆。大田软海绵酸中毒后无特效药救治，沿海地区时有误食腹泻性贝类毒素污染的贻贝等而引发中毒，严重影响了人们的身体健康和海产品的开发利用。因此，建立快速、灵敏和可靠的大田软海绵酸的检测方法以及检测设备对保障海产品安全尤为重要。
[0003]目前大田软海绵酸的生物检测方法中常用的有小鼠生物法和酶联免疫吸附检测法(ELISA)等，其中小鼠生物法比较直观，可直接判断该样品是否可供使用，但检测周期长、灵敏度低、个体差异大，不能确定毒素的组成成分，定量困难，假阳性率高、重现性差。ELISA法具有较高的敏感度，但ELISA法中抗体往往只针对主要成分，其类似物可能会产生交叉反应，从而出现假阳性或对毒性的估计不准确，而且单克隆抗体的制备困难，试剂盒价格昂贵，我国目前尚没有商品化ELISA试剂盒可售。
[0004]申请号为ZL201010266834.9 (授权公告号为CN101975768B)的中国发明专利《腹泻性贝类毒素检测方法》中公开了一种检测大田软海绵酸的方法，该方法通过建立大田软海绵诱导HL-7702肝细胞F-肌动蛋白(F-actin)解聚的标准曲线，根据HL-7702肝细胞F-actin解聚的标准曲线进行OA浓度的计算，建立腹泻性贝类毒素的细胞F-actin检测方法，确定可能的检出限范围，同时选择与腹泻性贝类毒素可能共存的成分STX、DA、YTX中的一种或几种作用HL-7702肝细胞，通过检测其破坏HL-7702肝细胞F-actin聚合能力的大小确定该方法测定OA含量的特异性。该方法与小鼠生物法相比具有符合3R原则、灵敏度高、特异性较好、重复性好以及样品提取简便，基质效应低等优点；与ELISA法相比具有特异性较好，灵敏度更高的优点，但该方法中以细胞为实验对象，培养周期和成本较高，且检测结果不直观，不适应快速检测的需要。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性高、检测周期短以及成本低的用于检测大田软海绵酸的生物传感器。
[0006]本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种上述生物传感器的制备方法。
[0007]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种用于检测大田软海绵酸的生物传感器，包括绝缘性基体、形成在该基体上的含有工作电极、参比电极和对电极的电极系统，其特征在于，所述工作电极上固定有生物酶层，该生物酶层包括蛋白磷酸酶2A(PP2A酶)以及电子传递体。
[0008]所述电子传递体为对硝基苯磷酸二钠盐，对硝基苯磷酸二钠盐在PP2A作用下产生对硝基苯和磷酸盐离子，对硝基苯磷酸二钠盐的去磷酸化反应可以电化学信号记录。
[0009]作为优选，所述参比电极为Ag/AgCl电极，对电极为石墨电极，Ag/AgCl电极是重现性和稳定性最好的参比电极之一，对电极在三电极系统中仅起到与工作电极形成回路，以使电极系统中电流通过的作用，因此选择较稳定的石墨作为对电极。
[0010]上述技术方案中用于检测大田软海绵酸的生物传感器的制备方法中所述PP2A酶通过光交联法或琼脂糖包埋法固定在所述工作电极上。
[0011]所述光交联法的具体步骤为:
[0012](I)将PP2A酶溶解在pH8?8.7的缓冲液A中制成I?2个单位/ul的酶溶液，在该酶溶液中加入PVA-AWP，所述PP2A酶与所述PVA-AWP的质量比为I?2:1，均质后形成固定溶液，所述缓冲液A包含Tris - HC1.EDTA以及MgCl2，所述I单位PP2A酶为在25°C下Imin内裂解所述对硝基苯磷酸二钠盐所需的酶量；
[0013](2)然后滴加2.5?3.5ul所述固定溶液(包含1_3个单位的PP2A酶)至工作电极表面，3?5°C下在功率为12?15W的日光灯下照射3?6h ;
[0014](3)光照后，3?5°C下干燥12?24h，干燥后用双蒸水冲洗，以去除物理吸附的多余的PP2A酶，将制得的固定化PP2A酶电极在4 °C下保存备用。
[0015]作为优选，上述缓冲液A包含30mM Tris - HCl、2mM EDTA和20mM MgCl2, pH值为8.4。
[0016]所述琼脂糖包埋法的具体步骤为:
[0017](I)将0.1?0.2g琼脂糖加入到50?100ml pH为8?8.7的Tris - HCl缓冲液中，55?65°C加热4?6min，充分溶解后得琼脂糖溶液，待该琼脂糖溶液降温至20?27°C时，将PP2A酶加入到琼脂糖溶液中并充分混合形成混合液，该混合液中PP2A酶的浓度为I?2个单位PP2A酶/ul，其中所述I单位PP2A酶为在25°C下Imin内裂解所述对硝基苯磷酸二钠盐所需的酶量；
[0018](2)上述混合液3?5°C放置11?13h后，取2.5?3.5ul滴涂于所述工作电极表面，室温下干燥成膜5?6h ;
[0019](3)干燥后用双蒸水冲洗，以去除物理吸附的多余的PP2A酶，将制得的固定化PP2A酶电极在4 °C下保存备用。
[0020]与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明利用大田软海绵酸对PP2A酶活力的抑制作用制成以PP2A酶为固定化酶层的生物传感器，通过PP2A酶活性抑制的程度测定样品中大田软海绵酸含量的高低，即将样品中大田软海绵酸浓度转换为电信号进行检测，检测结果更加直观，同时利用PP2A酶促反应的专一性和高效性，使得检测过程特异性高，检测结构准确率高，同时检测周期短，可实现即时、快速检测的需要，本发明用于检测水产品大田软海绵酸时，检出限低于1.00μ g/L、重现性RSD〈5%，检测耗时小于0.5h。
【附图说明】
[0021]图1为本发明中用于检测大田软海绵酸的生物传感器的结构示意图；
[0022]图2为本发明中用于检测大田软海绵酸的生物传感器的原理示意图；
[0023]图3为本发明中不同浓度的标准液中大田软海绵酸对PP2A酶活性的抑制率(％)。
【具体实施方式】
[0024]以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0025]如图1所示，一种用于检测大田软海绵酸的生物传感器，包括PVC膜基体1，该基体I上丝网印刷有含工作电极2、参比电极3和对电极4的三电极系统，且工作电极2、参比电极3和对电极4分别通过传导带5与基体I外的传导终端6连接。工作电极2近似圆形以方便样品的滴加，参考电极3和对电极4呈圆弧状，对称设置在工作电极2的两侧，工作电极2上固定有生物酶层21,该生物酶层21包括蛋白磷酸酶2A(PP2A)(Upstate B1technology,美国)以及电子传递体。如图2所示，对硝基苯磷酸二钠盐在PP2A酶作为下分解为对硝基苯酚和磷酸盐离子，大田软海绵酸是PP2A酶的烈性抑制剂，能抑制蛋白磷酸酶活性而导致蛋白质过磷酸化，本发明利用大田软海绵酸对PP2A酶活力抑制的这一特性，选用硝基苯磷酸二钠盐(西格玛奥德里奇公司，美国)作为电子传递体，Ag/AgCl电极作为参比电极，石墨电极作为对电极，从而构成用于检测大田软海绵酸的生物传感器。
[0026]以下通过实施例1-1、1_2、1-3、2-1、2-2和2-3来具体阐述上述生物传感器的制备方法:
[0027]实施例1-1:
[0028]清洗表面具有工作电极、参比电极和对电极的PVC膜基体(西格玛奥德里奇公司，美国)，烘干备用。将PP2A酶溶解在pH为8.4包含30mM Tris-HCl, 2mM EDTA和20mMMgC12的缓冲液A中，制成I个单位/ul的酶溶液，其中I单位PP2A酶为在25°C下Imin内裂解所述对硝基苯磷酸二钠盐所需的酶量。在该酶溶液中加入PVA-AWP (聚乙烯醇-具有叠氮化物单兀侧基的(azide-unit pendant)水溶性光聚合物，Toyo Gosey Kogyo corporat1n,日本)，PP2A酶与PVA-AWP的质量比为2:1，均质后形成固定溶液。然后滴加3ul固定溶液至工作电极表面，4°C下在功率为15