一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素sem的双抗夹心法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEM的方法，属于免疫学技术领 域，具体设及的是一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEM的双抗夹屯、法。
【背景技术】
[0002] 金黄色葡萄球菌肠毒素（staphylococcalenterotoxins，简称SEs)，是一种由金 黄色葡萄球菌分泌的细胞外毒素，其会导致中毒休克、食物中毒及一系列过敏性及免疫学 疾病。目前已发现的肠毒素有23种血清型，其中沈A-S邸称为传统肠毒素，SEG-SEX为新 型肠毒素。沈M属于新型肠毒素类型，其理论分子量为24. 842KD。据文献报道，S細基因W 基因簇（egc)的形式存在。由于肠毒素基因簇受同一操纵子调控。据调查显示，目前在多 药耐药性菌株中约77.8%含有基因簇（端T)。基于5細基因流行的广泛性，新型肠毒素SEM 也潜在威胁人类的健康。因此，食品及原料中SEM的检出，对于控制由金黄色葡萄球菌新型 肠毒素SEM引起的食源性疾病具有重要意义。
[0003] 目前检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法主要有免疫学法、分子生物学法和生物传 感器法。基于PCR技术的分子生物学方法从基因水平进行诊断，可W检测大量样品，具有高 灵敏度和特异性，可检测各类金黄色葡萄球菌的肠毒素基因。但PCR法只能判断葡萄球菌 携带肠毒素的基因型，胞外肠毒素蛋白的表达往往受时间、水分活度（AW0. 85~0. 99)、酸碱 度（pH4. 0~7. 0)和温度（8°C~30°C)等因素的影响，用PCR方法很难准确测定食品或临床 样本中肠毒素蛋白的含量。
[0004] 生物传感器技术因其具有自动化、检样量少、分析速度快、生物功能膜可多次使 用等优点受到国内学者的亲睐。目前检测金黄色葡萄球菌肠毒素用的较多的生物感应器 主要为免疫感应器。最新研发的电化学免疫传感器检测B型肠毒素，其最低检出限可达 0. 017ng/mL。该技术目前也仅限于检测传统的肠毒素，并且由于该方法检测成本高，检测稳 定性较差，该方法的发展受到限制。
[0005] 免疫学检测法依靠抗原抗体的结合，只发生在抗原决定簇与抗体结合位点之间。 由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，因此，免疫学检测法具有高度的特异性。酶 联免疫吸附（ELISA)法因其具有操作简单、低成本、灵敏度高，特异性强、重复性强、稳定性 高等优点，成为国内外研究热点。
[0006] 对于金黄色葡萄球菌肠毒素的检测，现有的利用双抗体夹屯、法检测传统A型肠毒 素的技术较为成熟，其灵敏度高达〇.〇282ng/mL。但利用双抗体夹屯、法检测新型肠毒素的报 道不多，对于一系列新型肠毒素（SEG-沈X)如沈M等的双抗夹屯、检测方法的研究将具有相 当广泛的应用价值。
【发明内容】
[0007] 本发明的主要目的在于提供一种即可定性分析、也可定量检测，且灵敏度高、准确 度高的检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素沈M的双抗夹屯、法。
[000引为达到上述目的，本发明的技术方案如下； 一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEM的双抗夹屯、法，包括W下步骤： (1) 用包被抗体包被酶标板，洗板，用于洗去未与酶标板结合的包被抗体，该包被抗体 为沈M单克隆抗体； (2) 加入封闭液对酶标板上多余结合位点进行封闭，洗板，用于洗去酶标板上多余封闭 液； (3) 在酶标板上加入样品，解育后洗板； (4) WSEM兔抗血清为一抗加入酶标板，反应后洗板，再W辣根过氧化物酶标记的羊抗 兔IgG为酶标二抗，反应后洗板； (5) 加入显色液使酶标板显色，然后加入硫酸终止反应，用酶标仪检测004。。， (6) 将检测得到的0045。值带入标准曲线即可求得样品中沈M的含量； 当样品中SEM浓度> 0. 5ng/mU样品中SEM被配对抗体捕获与酶标二抗结合，并催化 底物在450nm产生吸收值时，被判定为阳性； 当样品中SEM浓度< 0. 5ng/mU样品中SEM不被配对抗体捕获或者捕获数量太小不足W引起足够的信号时，被判定为阴性。
[0009]本发明记载的方法对不同浓度的标准沈M进行0〇45。值检测后，得到的线性范围良 好，可W直接做成标准曲线，通过对样品的〇〇45。值检测后，用该值在标准曲线上找出对应的 浓度，即可实现对样品的定量检测。
[0010] 兔抗血清中存在非特异性蛋白，因而其很难达到较高的特异性，若单独选作包被 抗体，易造成假阳性，不利于SEM抗原蛋白检测，导致检测准确率较低。本发明将仅针对一 种抗原决定簇的SEM单克隆抗体作为包被抗体，将SEM兔抗血清作为一抗加入反应体系中， 不仅克服了直接使用兔抗血清所带来特异性问题，还提高了方法的灵敏度和准确性。
[0011] 目前常采用的Dot-ELISA检测法W硝酸纤维膜（NC)为固相载体，据文献报道，硝 酸纤维膜对蛋白的固定易受到非特异性蛋白、氨键作用干扰物、疏水作用干扰物的影响，从 而使膜上蛋白物理吸附能力变弱，易造成假阴性。而本发明采用聚苯己締酶标板作为固相 载体，其物理吸附能力较强，性质稳定，因而能克服因蛋白吸附问题而造成的假阴性。
[0012] 进一步，本发明优化了抗体包被浓度、一抗稀释度、酶标二抗稀释度、包被液、封闭 时间、标准品解育时间、酶标抗体解育时间、3. 3'，5, 5'-四甲基联苯胺（TMB)显色时间等。 通过该条件的设置可使最低检测限为0. 5ng/mL，R2达到0. 9985。
[0013]本发明中各步骤的具体工作条件和过程如下： 所述步骤（1)的具体过程如下：用1.8~2. 7yg/mL的SEM单克隆抗体包被酶标板并在 4°C过夜，该SEM单克隆抗体的加入量优选为100yL/孔； 所述步骤（2)的具体过程如下；^59(^20%脱脂奶粉为封闭液，在37°C下封闭比~化，该 封闭液的加入量优选为200yL/孔； 所述步骤（3)中解育的温度为37°C，解育的时间为60~90min; 所述步骤（4)中一抗加入后在37°C下反应比；所述酶标二抗加入后在37°C下反应 30~45min。该一抗和酶标二抗的加入量均优选为100uL/孔； 所述步骤（5)中显色液加入后在37°C避光显色7~10min;所述硫酸浓度为2mol/L。 该显色液和硫酸的加入量均优选为100yL/孔； 其中，所述步骤（1)中的包被抗体、步骤（2)中的封闭液、W及步骤（4)中的一抗和酶标 二抗均采用抑=7. 4的1XPBS进行稀释，一抗的稀释比例为1:2000~1:4000,酶标二抗的稀 释比例为1:6000~1:8000 ; 所述步骤（1)~步骤（4)中洗板的操作过程如下；倒去酶标板孔内液体，在吸水纸上拍 干，用含0. 05%Tween-20的PBST加满孔，静置3min,反复洗漆3~5次。
[0014] 所述显色液由10mL显色液A、125yL显色液B、15yL3%的&〇2配置而成；其 中显色液A由3. 5g的化2册〇4.12&0、1. 1g的巧樣酸混合后加水至200ml，并调节抑值 至5. 0后制得；显色液B由6mg的3. 3'，5, 5' -四甲基联苯胺（TMB)加入1血二甲基亚讽 (DMS0)混合制得。
[0015]本发明与现有技术相比，具有W下优点及有益效果： 1、 本发明不仅能有效对新型肠毒素SEM进行定性分析，还能有效对新型肠毒素M进行 定量检测，且检测准确度高； 2、 本发明中的试剂稳定、易保存，且操作简单、低成本、灵敏度高，特异性强、重复性强、 稳定性高；且本发明能同时检测大量样品，适用于金黄色葡萄球菌肠毒素SEM蛋白的检测 和流行病学调查，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明方法检测得到的SEM标准曲线。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合实施例及其附图，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式 不限于此。 实施例
[0018] 一、准备阶段 本阶段用于配置好相应浓度的各试剂物品等，本发明中所用试剂物品包括；包被抗体、 封闭液、样品、一抗、酶标二抗、显色液、硫酸。其中，酶标板为96孔聚苯己締可拆酶标板；该 包被抗体为SEM单克隆抗体，SEM单克隆抗体浓度为1.8~2. 7yg/mU封闭液浓度为5%~20% 的脱脂奶粉溶液，该SEM单克隆抗体和封闭液均采用抑=7. 4的1XPBS配置而成。样品包 括检测样品和浓度分别为 0. 5ng/mL、lng/mL、2. 5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、 20ng/血的沈M标准品稀释液。一抗为沈M兔抗血清，酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的 羊抗兔IgG，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG为市售产品，购自武汉=鹰生物技术有限公 司。硫酸浓度为2mol/L。
[0019] 二、测定阶段 首先，绘制出沈M的标准曲线。本阶段采用一种检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素沈M的双抗夹心法，用于检测出不同样品的〇〇45。值，具体操作方法如下： (1) 在酶标板上加入包