n的速度洗脱至吸收值A在 280皿<0. 008。用已经加入100yL中和缓冲溶液的1. 5mlEP管分管收集洗脱液，混匀后用 抑试纸检查洗脱液的抑，如果抑低于7可利用中和缓冲液调至约抑7. 4W防止抗体的变 性；
[0127] 利用分光光度计测定各管中蛋白质的含量。若蛋白浓度低于0.5mg/ml可加入 1〇%的甘油^便保存，将纯化的136抗体分装后在21：~81：保存；
[012引用含0. 05 %叠氮化轴的TBS缓冲溶液清洗柱子后，将柱子储存在2C~8C环境。
[0129] ( H ) IgG抗体与人源IgG化偶联
[0130] 材料与仪器
[0131] 1、人IgGFc，由浩欧博生物医药有限公司研制，W磯酸盐缓冲液保存；
[0132] 2、木瓜蛋白酶消化液（Papain溶解液）；0.1MTris，2mM邸TA，P服.0。
[013引3、Papain,lodoacetamide,购自Sigma公司。Protein-A购自GE公司。
[0134] 4、偶联剂4-(N-马来醜亚胺基甲基）环己焼-1-駿酸玻巧醜亚胺醋（SMCC)，2-亚 胺四氨喔吩（2-IT)购自T肥RM0公司，H轻甲基氨基甲焼（TRI巧等化学试剂均达到化学 纯；
[0135] 5、G-25凝胶柱和Se地adex200凝胶纯化柱为GE公司产品。
[0136] 操作步骤
[0137] 1、人IgG，纯度为95%，浓度为Img/ml，先用Papain消化液（也叫溶解液），抑= 8. 0透析，然后加入浓度为PapainJgG= 100:1 (w/w)进行消化30min，再在消化液中加入 lodoacetamide终止反应，使用ProteinA将IgG化部分纯化出来。
[0138] 2、取Img的IgG抗体溶液，加入5mg/ml的SMCC溶液15yL，室温静置30min，用 G-25凝胶柱除游离SMCC，收集活化后抗体，4C保存备用；
[013引 3、取1.5mg人源IgG化部分，加入lOmg/ml的偶联剂2-IT溶液3iiL，室温静置 20min，加入0.Imol/L的甘氨酸溶液lOy1，室温静置5min。用G-25凝胶柱除游离的2-IT， 收集活化后抗体，4C保存备用；
[0140] 4、将上述活化的IgG抗体与活化的人源IgG化部分混合，在抑7. 3的条件下静 置20h，用Se地adex200凝胶纯化柱纯化偶联物，获得连接物浓溶液，4C保存备用；
[01川 5、将IgG-IgG化连接物浓溶液用含0. 5%牛血清白蛋白、抑8.0、0.Imol/L的TRIS缓冲液稀释到0. 5yg/ml，即得PCNA自身免疫性抗原的阳性血清。
[0142](四）用欧蒙公司生产的自免原（PCNA)IgG抗体检测盒对实施例2制备得到的阳 性血清进行测定，结果如表6:
[014引表6
[0144]
[0145] 注；欧蒙自免抗体IgGQgM，IgA)检测；cutoff值为20RU/mU即〉20RU/mL判断为 阳性，<20RU/mL判断为阴性；
[0146] 从表6可见，3批次ODT140403、L0T140517、L0T140802)的阳性血清质控样本， 用欧蒙自免原IgG检测试剂盒测定为阳性样本，3倍、9倍稀释后仍为阳性。另外从表格中 可W看到，质控样本倍比稀释后，测定值也为倍比稀释的。综合说明我们的样本制备成功， 可W作为样本用于试剂盒的质控。
[0147] W上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人±能够了解本 发明的内容并加W实施，并不能W此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所 作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种自身免疫性抗原阳性血清的纯化制备方法，包括用自身免疫性抗原对健康动 物进行免疫、采血后获得抗血清的步骤和对所述的抗血清进行纯化获得阳性血清的步骤， 其特征在于：所述的纯化的具体方法为： 对所述的抗血清进行亲和纯化得到抗体IgG ;将所述的抗体IgG和人源IgG Fc或人源 IgM Fc或人源IgA Fc按质量比为1:1~2偶联后，经分离纯化获得IgG-IgG Fc连接物浓 溶液或IgG-IgM Fc连接物浓溶液或IgG-IgA Fc连接物浓溶液，将所述的IgG-IgG Fc连接 物浓溶液或所述的IgG-IgM Fc连接物浓溶液或所述的IgG-IgA Fc连接物浓溶液稀释至浓 度为0. 5~I y g /ml，即得所述的阳性血清。2. 根据权利要求1所述的自身免疫性抗原阳性血清的纯化制备方法，其特征在于：采 用琼脂糖亲和介质或者采用免疫亲和层析柱进行所述的亲和纯化。3. 根据权利要求2所述的自身免疫性抗原阳性血清的纯化制备方法，其特征在于：所 述的琼脂糖亲和介质为Protein-A sepharose CL-4B。4. 根据权利要求2所述的自身免疫性抗原阳性血清的纯化制备方法，其特征在于：所 述的免疫亲和层析柱为所述的自身免疫性抗原与琼脂糖凝胶连接成的亲和层析柱。5. 根据权利要求2或4所述的自身免疫性抗原阳性血清的纯化制备方法，其特征在 于：所述的抗血清先经过硫酸铵处理后，再采用所述的免疫亲和层析柱进行所述的亲和纯 化。6. 根据权利要求1所述的自身免疫性抗原阳性血清的纯化制备方法，其特征在于：所 述的人源IgG Fc或人源IgM Fc或人源IgA Fe,是将人源IgG或人源IgM或人源IgA溶解 在木瓜蛋白酶消化液中，再用木瓜蛋白酶进行消化，然后用碘乙酰胺终止消化反应后，用琼 脂糖未和介质提取获得的。7. 根据权利要求1所述的自身免疫性抗原阳性血清的纯化制备方法，其特征在于：所 述的IgG抗体和所述的人源IgG Fc或人源IgM Fc或人源IgA Fc通过2-亚胺四氢噻吩偶 联剂或4-(N-马来酰亚胺基甲基）环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯偶联剂活化后，在pH7. 2~ 7. 4的条件下进行所述的偶联。8. 根据权利要求7所述的自身免疫性抗原阳性血清的纯化制备方法，其特征在于：所 述的2-亚胺四氢噻吩偶联剂的浓度为9~llmg/ml，所述的4-(N-马来酰亚胺基甲基）环 己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯偶联剂的浓度为4~6mg/ml。9. 根据权利要求1所述的自身免疫性抗原阳性血清的纯化制备方法，其特征在于：采 用Sephadex200凝胶纯化柱进行所述的分离纯化。10. 根据权利要求1所述的自身免疫性抗原阳性血清的纯化制备方法，其特征在于： 采用含质量比为〇. 4~0. 6%的牛血清白蛋白、pH7. 5~8. 5、0. 09~0. llmol/L的三羟 甲基氨基甲烷缓冲液将所述的IgG-IgG Fc连接物浓溶液或IgG-IgM Fc连接物浓溶液或 IgG-IgA Fc连接物浓溶液进行所述的稀释。
【专利摘要】本发明涉及一种自身免疫性抗原（简称自免原）阳性血清的纯化制备方法，包括用自身免疫性抗原对健康动物进行免疫、采血获得抗血清的步骤和对抗血清进行纯化获得阳性血清的步骤，纯化的具体方法为：对抗血清进行亲和纯化得到IgG抗体；将IgG抗体和人源IgGFc或人源IgMFc或人源IgAFc按质量比为1:1～2偶联后，经分离纯化获得IgG-IgGFc连接物浓溶液或IgG-IgMFc连接物浓溶液或IgG-IgAFc连接物浓溶液，然后稀释至浓度为0.5～1μg/ml，即得阳性血清。本发明方法可批量制备各种自身免疫性抗原的阳性血清，并且本制备方法简单易行。
【IPC分类】G01N33/96
【公开号】CN104977419
【申请号】CN201410553407
【发明人】李庆春, 王洪, 孙婵, 夏波, 马竹凤, 柳乐, 王秀伟
【申请人】苏州浩欧博生物医药有限公司
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2014年10月17日
【公告号】CN103901218A