标记抗体的制造方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种标记抗体的制造方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，数nm~lym左右的微粒被用于各种领域而受到注目。例如，用于吸附剂、 催化剂等的多孔质二氧化娃颗粒或沸石颗粒，用于颜料的碳黑、金属氧化物颗粒、无机化合 物颗粒，用于导电材料的金属纳米颗粒，用于树脂的补强剂的二氧化娃颗粒等，上述微粒的 材质及用途设及多个方面。另外，尤其是在生物技术的领域，半导体纳米颗粒、或含有巧光 色素的二氧化娃纳米颗粒等作为新型标记用颗粒的应用备受期待。另外，含有高浓度色素 的二氧化娃纳米颗粒具有高摩尔吸光系数，因此作为更高感度的标记用颗粒的应用受到期 待。
[0003] 上述标记用颗粒通过使具有与特定目标分子结合的能力的生物分子（蛋白质或 核酸等）键合在其表面，从而可用作能够用于目标分子的检测、定量、染色等的标记试剂。
【发明内容】
[0004] 本发明的课题在于提供一种用于制造标记抗体的方法，该标记抗体是抗体键合在 含有巧光色素等功能性分子的二氧化娃纳米颗粒（W下也称作含功能性分子的二氧化娃 纳米颗粒）的表面而成的，其中，该方法是用于制造下述标记抗体：在免疫测定中减少非特 异性吸附、且提高作为检测对象的目标抗原的捕捉效率（对目标抗原的结合效率）。
[0005] 另外，本发明的课题在于提供一种标记抗体，该标记抗体是使抗体键合在含功能 性分子的二氧化娃纳米颗粒的表面而成的，其中，该标记抗体在免疫测定中减少非特异性 吸附、且提高作为检测对象的目标抗原的捕捉效率。
[0006] 本发明人发现，使抗体键合在含功能性分子的二氧化娃纳米颗粒的表面而成的标 记抗体中，其对目标抗原的结合能力（目标抗原的捕捉能力）根据抗体在该二氧化娃纳米 颗粒表面的键合方式而有较大变动。并且发现，若使抗体的駿基与二氧化娃纳米颗粒表面 的硫醇基经由连接分子而键合，并将该种形态的标记抗体用于免疫测定，则非特异性吸附 被大幅抑制，并且目标抗原的捕捉能力大幅提高。本发明是基于该些见解而完成的。
[0007] 本发明的课题是通过下述手段而达成的。
[0008] < 1 >-种标记抗体的制造方法，其包含下述工序；a)使含有功能性分子且表面 具有硫醇基的二氧化娃纳米颗粒与具有马来酷亚胺基及胺基的连接分子共存在溶剂中，由 此在上述硫醇基与上述马来酷亚胺基之间形成硫離键，获得键合有连接分子且含功能性分 子的二氧化娃纳米颗粒，及
[0009] b)使上述键合有连接分子且含功能性分子的二氧化娃纳米颗粒、碳二亚胺及抗体 共存在水系溶剂中，在上述连接分子所具有的胺基与上述抗体所具有的駿基之间形成酷胺 键。
[0010] < 2 >如上述< 1 >的标记抗体的制造方法，其中，工序a)中的溶剂是非质子性 溶剂。
[0011] < 3 >如上述< 1 >或< 2 >的制造方法，其中，非质子性溶剂选自二甲基亚讽、 环了讽、化晚、N-甲基化咯烧酬、N-环己基化咯烧酬、N，N-二甲基甲酯胺、及N，N-二甲基己 酷胺。
[001引 < 4 >如上述< 1 >~< 3 >中任一项的制造方法，其中，连接分子的结构是马来 酷亚胺基与胺基经由2价的脂肪族基或亚芳香基（arylene)或者它们的组合连结而成的结 构。
[001引 < 5 >如上述< 1 >~< 4 >中任一项的制造方法，其中，标记抗体的平均粒径为 20 ~500nm。
[0014] < 6 >如上述< 1 >~< 5 >中任一项的制造方法，其中，功能性分子选自由巧光 分子、吸光分子、磁性分子、放射性分子及抑敏感性分子组成的组。
[00巧]< 7 >如上述< 1 >~< 6 >中任一项的制造方法，其中，在含有功能性分子且表 面具有硫醇基的二氧化娃纳米颗粒中，存在于表面的硫醇基的密度为0. 002~0. 2个/nm2， 抗体的键合量受该硫醇基的量控制。
[0016] < 8 >-种标记抗体，其是W含有功能性分子的二氧化娃纳米颗粒作为标记颗粒 且抗体经由连接基而键合在其表面而成的，其中，
[0017] 上述含有功能性分子的二氧化娃纳米颗粒与上述连接基通过硫離键连结，上述抗 体与上述连接基的连结结构为*-C( = 0)-NH-(*表示抗体侧）。
[0018] < 9 >如上述< 8 >的标记抗体，其中，连接基具有2价的脂肪族基或亚芳香基或 者它们的组合。
[001引 < 10 >如上述< 8 >或< 9 >的标记抗体，其中，平均粒径为20~500皿。
[0020] < 11 >-种胶体，其是上述< 8 >~< 10 >中任一项的标记抗体分散在分散介 质中而成的。
[002。 < 12 >如上述< 11 >的胶体，其中，分散介质为缓冲液。
[0022] < 13 >-种分析试剂，其含有上述< 8 >~< 10 >中任一项的标记抗体。
[0023] 通过本发明的标记抗体的制造方法（W下也简单称为本发明的制造方法），可获 得免疫测定中的非特异性吸附被进一步抑制、且目标抗原的捕捉能力进一步提高的标记抗 体。另外，通过本发明的制造方法，由于抗体的键合量受含功能性分子的二氧化娃纳米颗 粒表面的硫醇基的量控制，因此可更精密地控制抗体在该二氧化娃纳米颗粒表面上的键合 量。
[0024]本发明的标记抗体在免疫测定中的非特异性吸附更少，另一方面，目标抗原的捕 捉能力进一步提高。另外，本发明的标记抗体是抗体经由连接分子而与含功能性分子的二 氧化娃纳米颗粒表面通过共价键牢固且稳定地键合，因此抗体难W自含功能性分子的二氧 化娃纳米颗粒脱离。
[00巧]本发明的上述W及其它特征及优点可适当参照附图，根据下述记载而更加明了。【附图说明】
[0026]图1是示意性地表示实施例所使用的免疫层析装置的试带的结构的图。图1中 (a)表示俯视图，化）表示纵截面图。
【具体实施方式】
[0027] W下基于本发明的优选实施方式而对其进行详细说明。
[0028] 本发明的制造方法中，使用含有功能性分子且表面具有硫醇基的二氧化娃纳米颗 粒。该二氧化娃纳米颗粒具备作为所谓标记用颗粒的性能。本发明的制造方法中，使特定 的连接分子经由该二氧化娃纳米颗粒表面的硫醇基而共价键合在上述二氧化娃纳米颗粒， 并进而使该抗体经由抗体所具有的駿基而共价键合在该连接分子的其它部位。由此，可获 得键合有与上述二氧化娃颗粒表面的硫醇基的量相对应的量的抗体的标记抗体。W上述方 式获得的标记抗体可用于各种诊断试剂、检查试剂等分析试剂。
[0029] 上述含功能性分子的二氧化娃纳米颗粒中的"功能性分子"并无特别限制，优选采 用分析试剂等中可成为检测指标的标记分子。作为该功能性分子，可例示巧光分子、吸光分 子、磁性分子、放射性分子、抑敏感性色素分子等，可使用它们中的1种或2种W上。
[0030] 含功能性分子的二氧化娃纳米颗粒可通过如下方法制备：获得通过共价键、离子 键及其它化学键或物理性吸附使功能性分子与硅烷偶联剂键合而成的生成物（键合有功 能性分子的有机烷氧基硅烷），使该生成物与1种或2种W上硅烷化合物（硅氧烷成分）在 例如含氨水的溶剂中水解、缩聚而形成硅氧烷键，由此制备上述含功能性分子的二氧化娃 纳米颗粒。
[0031] 作为上述含氨水的溶剂，例如可使用在将水/己醇W体积比计设为1/10~1/1的 混合液中按照氨浓度为0. 2~3wt%的方式添加例如28%左右的氨水而成的溶液。
[0032] 上述硅烷化合物（硅氧烷成分）并无特别限制，例如，如四己氧基硅烷（TE0巧或 四甲氧基硅烷该样的四烷氧基硅烷，除此W外，也可使用丫 -琉丙基S甲氧基硅烷（MP巧、 丫-琉丙基二己氧基硅烷、丫-胺基丙基二己氧基硅烷（APS)、3-硫氛基丙基二己氧基硅烷、 3-缩水甘油離氧基丙基=己氧基硅烷、3-异氯酸醋基丙基=己氧基硅烷、3- [2- (2-胺基己 基胺基）己基胺基]丙基=己氧基硅烷等硅烷偶联剂。其中，可优选地使用TE0S。
[0033] 需要说明的是，若使用MI^S等具有硫醇基的物质作为上述硅烷化合物，则所得的 含功能性分子的二氧化娃纳米颗粒的表面存在硫醇基，因此无需后文叙述的向含功能性分 子的二氧化娃纳米颗粒表面导入硫醇基的操作。
[0034] 在使功能性分子与硅烷偶联剂共价键合的情况下，例如，可使用具有N-哲基了二 酷亚胺（N服）醋基、马来酷亚胺基、异氯酸醋基、异硫氯酸醋基、醒基、对硝基苯基、二己氧 基甲基、环氧基、氯基等活性基的功能性分子与具有可与上述活性基反应的官能基（例如 胺基、哲基、硫醇基等）的硅烷偶联剂。
[003引具有N服醋基的功能性分子中，作为该功能性分子为巧光分子的情况下的优选 例，可列举5-(及-6)-駿基四甲基罗丹明-NHS醋（商品名，empBiotechGmbH公司制造）、 下式所表示的DY550-NHS醋、下式所表示的DY630-NHS醋（均为商品名，DyomicsGmbH公 司制造）等具有N服醋基的巧光色素化合物，但本发明并不限于此。
[0036]
[0037] 在功能性分子具有了二酷亚胺基的情况下，可使其与具有胺基的硅烷偶联剂键 合。作为具有胺基的硅烷偶联剂的具体例，可列举丫-胺基丙基=己氧基硅烷（AP巧、 3-巧-(2-胺基己基胺基）己基胺基]丙基=己氧基硅烷、3-(2-胺基己基胺基）丙基二甲 氧基甲基硅烷、3-胺基丙基S甲氧基硅烷等。其中，可优选地使用APS。
[0038] W上述方式制备的含功能性分子的二氧化娃纳米颗粒的形状为长轴与短轴的比 为2W下的球状。另外，平均粒径优选为1~lOOOnm，更优选为20~500nm。
[0039] 该平均粒径可如下算出；利用图像处理装置自透射式电子显微镜（TE