一种快速检测羊肚菌菌丝活力的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测酶活的方法，更具体的说是一种检测食药用菌菌丝活力的方 法，属于生理活性物质检测领域。
【背景技术】
[0002] 羊肚菌（MorchellaesculentaL.)又名美味羊肚菌，俗称羊雀菌、包谷菌等，按 Ainsworth分类系统隶属于子囊菌亚门（Ascomycotina)、盘菌纲（Discomycetes)、盘菌目 (Pezizales)、羊肚菌科（Morchellaceae)、羊肚菌属（Morchella)。由于其菌盖是一个布满 凹陷和棱脊的网状体，形状似羊肚而得名。羊肚菌具有极高的营养价值和药用价值，是一类 大型的食用兼药用真菌。据测定，羊肚菌的蛋白质含量为22. 1%，含19种氨基酸以及锌、 硒、铁、锗、铜等多种微量元素和维生素&、B2、B12、烟酸、泛酸、生物素等多种维生素，其中包 括8种人体必需氨基酸，占氨基酸总量的47. 5% ( -般食用菌为25%~40% )，高于玉米、 小麦、大豆和肉类食品，有些营养成分的含量超过了 "冬虫夏草"。现代医学研宄表明，羊肚 菌有降血脂，调节免疫功能，抗疲劳、抗辐射、抗肿瘤作用，并能减轻癌症患者放化疗引起的 毒副作用。
[0003] 羊肚菌在国际市场上供不应求，且价格居高不下。因此，人工栽培羊肚菌一直是食 用菌界最感兴趣的课题之一。我国目前已经成功栽培出羊肚菌，云南利用椴木栽培羊肚菌， 四川是利用耕地栽培羊肚菌。
[0004] 羊肚菌菌种与其它食药用菌一样，属于真菌，遗传变异显著，优良性状不能完全稳 定遗传，且易老化或退化，给批量栽培带来了极大风险，也是比较棘手的问题。
[0005] 如何选择优良的生产种是栽培成功的关键，传统的方法是依据形态特征、生理生 态特性和栽培习性进行选种，但是羊肚菌菌种要求外界条件严格，受外界因素影响明显，导 致该法不准确，且费时费力。如果能在羊肚菌菌丝生长阶段快速、准确的检测菌种活力将大 大提高选种效率，同时节省成本。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种快速检测羊肚菌菌丝活力的方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种快速检测羊肚菌菌丝活力的方 法，包括如下步骤：
[0008] 1)菌丝培养：将待测菌株于母种平板培养基中培养后，切取平板上的菌块，转至 液体深层培养基中震荡培养，得菌液。
[0009] 优选的，将待测菌株于母种平板培养基中，23°C下培养10d后，切取平板上的菌 块，转至液体深层培养基中，23°C下150rpm震荡培养6d，得菌液。
[0010] 优选的，所述的母种平板培养基是：按重量百分比，去皮马铃薯20%，葡萄糖2%， 蛋白胨0.3%，腿 2?04 0.3%，]\%504.71120 0.15%，口11值7，水余量。
[0011] 优选的，所述的液体深层培养基是：按重量百分比，去皮马铃薯20%，葡萄糖2%， 蛋白胨 0.3%，KH2P04 0.3%，MgS04.7H20 0.15%，维生素BJOmg/L，水余量。
[0012] 2)样品前处理：取菌液于离心管中，离心，去除上清液，提取菌丝，以生理盐水冲 洗菌丝。
[0013] 优选的，取菌液于离心管中，4°C12000rpm离心5min，去除上清液，取菌丝，以生理 盐水冲洗菌丝。
[0014] 3)配制待测菌液：称量菌丝重量，加入水，配成待测菌液。
[0015] 优选的，待测菌液的浓度为0. 1-0. 2g/mL。更优选的，待测菌液的浓度为0. 15g/ mL〇
[0016] 4)与TTC反应：准确移取待测菌液、Tris-HCl缓冲液和TTC(2,3,5-氯化三苯基四 氮唑）溶液至离心管中反应。
[0017] 优选的，准确移取待测菌液、Tris-HCl缓冲液和TTC溶液至离心管中，于37°C下反 应 2-4h。
[0018] 优选的，所述的Tris-HCl缓冲液的pH值为8. 4。
[0019] 5)终止反应：反应后，立即将反应液放置冰上，4°C离心，得细胞沉淀，于离心后的 细胞沉淀中加入萃取剂，得萃取液。
[0020] 优选的，所述的萃取剂是无水乙醇。
[0021] 6)测定萃取液0D485:将萃取液离心，取上清液，于485nm波长下测定吸光度值。
[0022] 优选的，将萃取液于12000rpm离心5min，取上清液，于485nm波长下测定吸光度值 0D485〇
[0023] 本发明的有益效果是：
[0024] 1.本发明测定结果稳定可靠、重现性好、准确度高。酶是非常有效和特异性高的生 物催化剂。由于酶对环境条件的影响非常敏感，因此酶活性测定的影响因素较多，包括酶的 浓度、缓冲液类型、pH值、温度、时间等，而且不同生物体不同酶活性的测定条件并不一致。 本发明根据羊肚菌的特性，使TTC不易扩散进入细胞中的特点，经过反复试验，优化出最佳 试验方案，各种条件准确可控，测定结果准确度高、重现性好，并且稳定可靠。
[0025] 2.本发明所用药品、仪器种类少，试验步骤简单，便于操作，易于学习和掌握。
[0026] 3.本发明反应速度快，测定吸光度值简单、快速，整个检测过程时间短。
[0027] 4.本发明所用药品、试剂便宜，用量少，试验成本低。
[0028] 5.通过本发明的方法可以快速检测出羊肚菌菌种的优劣，再应用于扩大化生产 中，提高了成品的优质产率。
【具体实施方式】
[0029] 实施例一种快速检测羊肚菌菌丝活力的方法
[0030] (一）供试菌株：所用供试菌株见表1。
[0031] 表1供试菌株
[0032]
[0033] (二）试剂：
[0034] Tris-HCl缓冲液：pH8. 4 ;随用随配。
[0035] TTC溶液：重量百分浓度为0. 5 % ;随用随配。
[0036] 生理盐水：重量百分浓度为0. 85% ;
[0037] 母种平板培养基：按重量百分比，去皮马铃薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨0. 3%， 腿丨04 0.3%，]^04,71120 0.15%邛11值7，水余量。
[0038] 液体深层培养基：按重量百分比，去皮马铃薯20%，葡萄糖2%，蛋白胨0. 3%， KH2P04 0? 3%，MgS04 ? 7H20 0? 15%，维生素BilOmg/L，水余量。
[0039] (三）快速检测羊肚菌菌丝活力的方法
[0040] 1)菌丝培养
[0041] 将待测菌株于母种平板培养基中，23 °C下培养10d后，切取平板上的菌块(lcmXlcm) 2块，转至液体深层培养基中，23°C下150rpm震荡培养6d，得菌液。
[0042] 2)样品前处理
[0043] 取2mL菌液于离心管中，4°C12000rpm离心5min，去除上清液，取菌丝，以1ml生理 盐水冲洗菌丝，4°C12000rpm离心5min，去除上清液，重复4次。
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