雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的液相色谱-串联质谱检验方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物样品检验领域，具体涉及雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲 素和雷公藤红素的液相色谱-串联质谱检验方法。
【背景技术】
[0002] 雷公藤（TriptergiumwilfordiiHook. f)是卫矛科一年生藤本植物，是我国传统 医学中的一种常用中草药。雷公藤为卫矛科植物雷公藤的根。分布于长江流域以南及西南， 主产于长江中、下游地区。有报道称，目前从雷公藤属植物中分离得100余种成分，主要是 二萜类、三萜类、倍半萜类及生物碱类等，研宄表明，生物碱、二萜类等许多成分既是有效成 分又是有毒成分，以二萜类化合物毒性最强，主要对心、肝、胃肠道及骨髓等器官损伤严重。
[0003] 雷公藤甲素和雷公藤氯内醋醇（tripchlorolide)是雷公藤中活性最高的环氧二 萜内酯化合物，同时也是雷公藤引起毒副作用的主要成分，对心、肝、骨髓、胸、脾、肾及生殖 系统等都有一定的毒性。
[0004] 雷公藤红素是雷公藤三萜类成分，是雷公藤中分离到的第1个单体，虽具有多种 药理活性，但却是主要的毒性成分，且在雷公藤药物尤其是根皮、茎皮重含量很高。
【发明内容】
[0005] 本发明提供雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的液相色 谱-串联质谱检验方法，适用于生物样品（血、尿、肝、肾等）中雷公藤内酯甲、雷公藤内酯 酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的定性定量检验，也适用于体外样品和可疑物证的检验。
[0006] 本发明的原理是以空白样品和添加样品作对照，按平行操作的要求，对生物样品 进行提取、净化及浓缩后，用液相色谱-串联质谱仪进行检测，以保留时间（Rt)、质谱特征 离子碎片峰和相对丰度作为定性判断依据；与平行操作的添加标准品响应值比较，根据峰 面积之比，用外标法进行定量分析。
[0007] 具体的，本发明一方面的目的在于提供雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素 和雷公藤红素的液相色谱-串联质谱检验方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0008] a)取液体样品或组织样品剪碎于具塞试管中；上述样品加一定量的氢氧化钠溶 液调pH9~10,加入乙酸乙酯，振荡10min，高速离心10min ;分离有机相后，加有机溶剂 进行第二次提取，合并两次有机相，置于50°C浓缩仪上挥干；残渣用初始流动相定容，过 0. 22 y m微孔有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析；
[0009] b)样品分析：
[0010] 色谱柱：kinetex C18 ;进样量：lyL~10yL;流动相：A为含0. 1%甲酸的10mM 甲酸铵【本发明0. 1%甲酸的10mM甲酸铵是指：浓度为l〇mmol/L的甲酸铵水溶液中甲酸的 体积分数为〇. 1 %，以下不再赘述】，B为甲醇；梯度洗脱【本发明中的A、B均为体积分数，以 下不再赘述】：〇? 2min，A 为 95%，B 为 5% ;3. Omin，A 为 5%，B 为 95% ;5. Omin，A 为 5%，B 为 95% ;5. lmin，A 为 95%，B 为 5% ;7.0min，A 为 95%，B 为 5% ;流速为 0.5mL/min;
[0011] 离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描（ESI+);检测方式：多反应监测 (MRM);电喷雾电压：5500V ;离子源温度：650°C ;雾化气压力：55psi ;气帘气压力：50psi ; 辅助气压力：50psi。
[0012] 在本发明的另一个实施方案中，尤其是对于新鲜血液样品，其中a)样品前处理还 能够替换为：取生物液体样品或生物组织样品剪碎于具塞试管中；加入pH5. 8磷酸盐缓 冲液，充分混旋，超声15min，8000r/min以上高速离心20min，取上清液待过柱；取3CC HLB 固相小柱依次以3mL甲醇、3mL水活化，将离心后的上清液分别过柱，流速为0. 5mL/min~ 1. OmL/min ;再以3mL去离子水和0. 5%甲醇水溶液【本发明中0. 5%甲醇水溶液是指：甲醇 水溶液中甲醇的体积分数为〇. 5%，以下不再赘述】先后淋洗小柱；用4mL甲醇洗脱，收集洗 脱液置于50°C快速浓缩仪上吹干，残渣用初始流动相定容，过0. 22 y m微孔有机滤膜，滤液 供液相色谱-串联质谱仪分析。
[0013] 在本发明的一个具体的实施方式中，其中a)样品前处理步骤中，还包括另取3份 相同基质的空白样品，1份作为空白样品，另2份添加雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤 甲素和雷公藤红素标准l〇〇ng制备成添加样品，混匀；或者还包括另取相同基质的空白样 品两份，分别添加相应目标物标准品（添加量应与案件样品粗测量相近）制备成添加样品， 混匀。
[0014] 在本发明的一个具体的实施方式中，液体样品为血液、尿液、唾液；所述组织样品 为肝脏、肾脏。
[0015] 在本发明的一个具体的实施方式中，C18柱为3. 0mmX 50mm，2. 6 y m柱或等效色谱 柱。
[0016] 在本发明的一个优选的实施方式中，取液体样品1.0mL-2.OmL;或者组织样品 1. 0g-2. 0g〇
[0017] 在本发明的一个优选的实施方式中，乙酸乙酯的加入量为5. 0mL-10.0 mL。
[0018] 在本发明的一个优选的实施方式中，残渣用500 yL-1000 yL初始流动相定容。
[0019] 在本发明的一个优选的实施方式中，磷酸盐缓冲液的加入量为3mL-5mL。
[0020] 本发明另一方面的目的在于提供生物样品中雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公 藤甲素和雷公藤红素的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS)检验方法的应用，应用于法庭科学 领域，尤其是应用于生物样品中雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素的 定性定量检验，以及适用于体外样品和可疑物证的检验。优选地，所述生物样品为血、尿、 肝、肾。
[0021] 本发明的有益效果在于：本发明样品处理采用液液萃取或者固相萃取，操作简单， 样品用量少；采用LC-MS/MS灵敏度高，能有效的排除假阳性，定性、定量准确度高。
【附图说明】
[0022] 图1表示雷公藤甲素的液相色谱_质谱提取离子流图；
[0023] 图2表示雷公藤内酯酮的液相色谱-质谱提取离子流图；
[0024] 图3表示雷公藤内酯甲的液相色谱-质谱提取离子流图；
[0025] 图4表示雷公藤红素的液相色谱-质谱提取离子流图。
【具体实施方式】
[0026] 实施例1定性分析
[0027] 1、试剂
[0028] 本发明试验用水为一级水（见GB/T 6682-2008规定）：
[0029] a)磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠为分析纯；
[0030] b)甲醇、乙腈、二乙胺、异丙醇、醋酸铵、甲酸、乙酸乙酯、环已烷均为色谱纯；
[0031]c)磷酸盐缓冲液（pH 5. 8):取磷酸二氢钾8. 34g与磷酸氢二钾0.87g，，分别置于 1000mL容量瓶中，加一级水溶解、稀释至刻度；
[0032] d)含0. 1%甲酸的10mM醋酸铵：称取0. 384g的醋酸铵，加入一定量的一级水溶 解，并加入〇. 5mL甲酸混匀，将混合液用一级水稀释至500mL ;
[0033] e)标准溶液：
[0034] 1)雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准储备液：精确称 取雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准品各l〇mg，分别于10mL容 量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，配制成1.0mg/mL雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、 雷公藤甲素和雷公藤红素标准储备液，冷藏保存6个月；
[0035] 2)雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准工作液：精确量 取1.0mg/mL雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准储备液各10mL， 分别于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成0. 10mg/mL的雷公藤内酯甲、雷公藤内 酯酮、雷公藤甲素和雷公藤红素标准工作液，冷藏保存1个月。试验中所用其它浓度的标准 溶液均从上述储备溶液用甲醇稀释而得，冷藏保存为1个月。
[0036] 2、仪器和材料
[0037] a)液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI)和三重四极杆质量分析器；
[0038] b)电子天平：感量0?lmg和0? 01g;
[0039] c)高速离心机；
[0040] d)振荡器；
[0041] e)浓缩仪；
[0042] f)移液器：量程 10 y L ~100 y L，100 y L ~1000 y L，1000 y L ~5000 y L ;
[0043] g) pH试纸：范围1~14;
[0044] h)固相萃取小柱：HLB固相萃取柱或等效固相小柱；
[0045] i)微孔有机滤膜：0?22ym。
[0046] 3、样品萃取
[0047] 3. 1、液液萃取
[0048] 取血液等液体样品1. OmL~2. OmL或肝等组织样品1. 0g~2. 0g剪碎于具塞试管 中。另取3份相同基质的空白样品，1份作为空白样品，添加雷公藤内酯甲、雷公藤内酯酮、 雷公藤甲素和雷公藤红素标准品l〇〇ng制备成添加样品，混匀。
[0049] 上述样品加一定量的氢氧化钠溶液调pH9~10,加入5. OmL~10.0 mL乙酸乙酯， 振荡10min，高速离心10min。分离有机相后，加有机溶剂进行第二次提取，合并两次有机 相，置于50°C浓缩仪上挥干。残渣用500 yL~1000 yL初始流动相定容，过0.22 ym微孔 有机滤膜，滤液供液相色谱-串联质谱仪分析。
[0050] 3. 2、固相萃取（适用于新鲜血液）
[0051] 按3. 1项制备好样品，加入pH5. 8磷酸盐缓冲液3m