量子点定量检测RV病毒IgG抗体的免疫层析试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及免疫分析领域，尤其是涉及一种量子点定量检测RV病毒IgG抗体的免 疫层析试剂盒。
【背景技术】
[0002] 风疹病毒（rubellavirusRV)属于疱疹类病毒中的披膜病毒科风疹病毒属，是引 起风疹的病原体，为RNA病毒，人是其唯一宿主。病毒经过呼吸道传播，潜伏期约2~3周，病 毒增殖后进入血流引起病毒血症。风疹的临床表现类似麻疹，但较麻疹感染症状轻，合并症 少，受风疹病毒感染的成年人，症状如一般的感冒，先有感冒的一般症状及耳后和枕下淋巴 结肿大，随后面部出现潜红斑丘疹并迅速遍及全身，多在1~3天内消退，预后良好。人群中 感染率约为95%，常被人们忽视。
[0003] 孕妇在孕期6个月内感染风疹病毒，病毒可通过胎盘侵犯胎儿（垂直传播）， 除引起流产、死产外，活产者大约29%表现为"先天性风疹综合"（congenitalrubella syndrome，CRS)，即出生时体重低于2. 5公斤，发育迟缓；出生后全身性受损，先天性心脏 病，畸形，耳聋、失明等。CRS患儿最常见的是白内障等眼疾患， 其次是耳聋，60%有心血管系统缺损。统计数据表明全球每年平均有10万名CRS患儿 的高危人群。
[0004] 在病毒感染后，人体体液免疫系统所作出的第一个反应就是产生针对于风疹的 IgM抗体，感染后两周时该抗体在血清中的浓度达到最高值，并在1~2个月内维持该水平。 特异性的IgG抗体大约比IgM抗体产生的时间晚一周时间。并在感染后的6~8周内达到顶 峰，之后慢慢减少到一定水平（15~200IU/mL)，并保持一生。二次感染时都没有明显的 症状，仅仅能够检测到特异性IgG的血清水平适度的增高。准确的检测风疹病毒的IgG和 IgM抗体已经成为有效地诊断感染和继发性急性感染的工具，并用于调查产妇的免疫系统 状况，对于可疑的临产妇女做合适的预防措施。IgG检测被广泛的应用于接种后接种者血清 转换情况的评估，对妇女孕前进行RV-IgG抗体检测，对抗体阴性及抗体水平〈10IU/ml者进 行RV疫苗接种是预防CRS发生最理想和最有效的方法。虽然近年来，妊娠妇女风疹病毒感 染逐渐被重视，并将风疹病毒抗体作为产前检测指标之一，但对其产生的危害仍认识不足， 风疹疫苗接种仍未能普及。
[0005]目前的血清学抗体诊断技术都是基于RV结构蛋白的免疫检测技术，主要有间 接ELISA法检测RV-IgG、胶体金免疫层析法检测RV-IgG。ELISA法采用辣根过氧化物酶 (horseradishperoxidase，缩略词为HRP)或碱性磷酸酶标记抗体，并催化底物产生颜色变 化，具有操作简单，试剂稳定期长的特点，但ELISA法需要专用设备，反应时间比较长，检测 步骤繁杂，包括：加样、孵育、洗板、加底物显色、终止、检测等程序，检测时间超过90min，不 利于基层医院、门诊开展。胶体金免疫层析法目前应用比较广泛，操作简单、快速，但这种方 法中标记物的稳定性较差，颜色单一，灵敏度较低，受基质的背景干扰大，且只能定性检测， 不能做到精确定量。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于针对上述检测方法存在的缺陷而提供的一种量子点定量检测 RV病毒IgG抗体的免疫层析试剂盒，本发明采用量子点标记技术在灵敏度、特异性和稳定 性方面具有其他免疫性方法不可比拟的优势，具有灵活的应用开发前景。
[0007] 为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案： 本发明所述的量子点定量检测RV病毒IgG抗体的免疫层析试剂盒，包括检测试纸条、 系列标准品和样本稀释液，所述检测试纸条由依次粘贴在衬板上的吸水纸、硝酸纤维素膜、 结合垫、样品垫构成：所述硝酸纤维素膜检测区包被有RV病毒纯化抗原，其质控区包被有 羊抗鼠IgG多抗；所述结合垫是用量子点标记的鼠抗人IgG单克隆抗体溶液喷涂于聚酯玻 纤上干燥为固态。
[0008] 所述RV病毒纯化抗原的工作浓度为0.5~I. 5mg/ml，所述羊抗鼠IgG多抗的工作 浓度为〇? 8~2.Omg/ml。
[0009] 所述量子点为5~20nm的微球，量子点表面的活性基团为-COOH或-NH2,激发波 长300~330nm，发射峰位400~620nm。
[0010] 所述量子点标记采用1- (3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基丁 二酰亚胺共价交联方式标记鼠抗人IgG单克隆抗体制备量子点标记抗体。
[0011] 所述量子点标记的鼠抗人IgG单克隆抗体的标记浓度为5~10yg/ml，通过离心纯 化后用保存液稀释喷涂于聚酯玻纤上，所述保存液为PBS缓冲液与酪蛋白、牛血清白蛋白、 明胶、蛋白胨、动物血清中的一种或多种液体混合而成。
[0012] 所述系列标准品包括阴性校准品和高中低阳性校准品，所述阴性校准品包括PBS 缓冲液，所述阳性校准品包括PBS缓冲液和RV病毒IgG抗体；所述样本稀释液包括PBS缓 冲液和酪蛋白和表面活性剂。
[0013] 本发明的优点在于结合了量子点定量技术和免疫层析技术，具有操作简单、快速、 不受样本数量限制的优点，与胶体金免疫层析法相比灵敏度更高，可以定量检测人全血、血 清、血浆中RV病毒IgG抗体，更加方便对孕前妇女进行RV-IgG抗体水平的监测。
【附图说明】
[0014] 图1是本发明试剂盒中的试纸条结构示意图。
[0015] 图2是本发明试剂盒中校准品结果图。
[0016] 图3是本发明试剂盒中校准品曲线图。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行更为详细的阐述。
[0018] 本发明所述的量子点定量检测RV病毒IgG抗体的免疫层析试剂盒，包括检测试纸 条、系列标准品和样本稀释液，如图1所示，检测试纸条由依次粘贴在PVC衬板1上的吸水 纸2、硝酸纤维素膜3、结合垫4、样品垫5构成：硝酸纤维素膜检测线6包被有RV病毒纯化 抗原，其质控线7包被有羊抗鼠IgG多抗；结合垫4是用量子点标记的鼠抗人IgG单克隆抗 体溶液喷涂于聚酯玻纤上干燥为固态。本试剂盒中的系列标准品包括阴性校准品和高中低 阳性校准品，阴性校准品包括PBS缓冲液，阳性校准品包括PBS缓冲液和RV病毒IgG抗体； 试剂盒中的样本稀释液包括PBS缓冲液和酪蛋白和表面活性剂。
[0019] -、本发明试剂盒的制备方法为： 1、 硝酸纤维素膜3的检测线6、质控线7包被 将RV病毒纯化抗原用pH7. 5,0.OlM的PBS缓冲液稀释至0. 5~I. 5mg/ml，作为检测线 6的包被液，羊抗鼠IgG多抗用pH7. 5,0.OlM的PBS缓冲液稀释至0. 8~2.Omg/ml，作为质 控线7的包被液；使用试纸条专用划膜仪将检测线6的包被液和质控线7的包被液分别包 被到贴在PVC衬板1上的硝酸纤维素膜3上，置于恒温干燥箱37°C干燥2h以上； 2、 量子点标记鼠抗人IgG单克隆抗体结合垫4的制备 量子点偶联抗体为固定分离相，其中的抗体为鼠抗人IgG单克隆抗体，用于偶联的量 子点粒径5~20nm，量子点表面的活性基团为-COOH或-NH2,激发波长300~330nm，发射 峰位400~620nm，用于偶联的抗体浓度为5~10yg/ml; 通过化学交联试剂活化量子点，使之与鼠抗人IgG单克隆抗体的-COOH或-NH2基团共 价结合，形成稳固的量子点结合物。本实施例选用的活性基团为-COOH的量子点，-COOH基 团的磁微粒在化学交联剂N-羟基丁二酰亚