Ddr2突变作为黑素瘤或基底细胞癌的可靶向的特征的制作方法
【技术领域】
[0001] 本技术涉及在黑素瘤和基底细胞癌中DDR2基因中的新型突变。
[0002] 置量
[0003] 提供下列说明书以辅助读者理解。并不承认所提供的信息或引用的参考文献是本 发明的现有技术。
[0004] 黑素瘤和基底细朐癌
[0005] 皮肤癌是所有癌症中最为常见的一种，每年使多于一百万美国人受到其痛苦，该 数字在快速上升中。如果在早期诊断和治疗，其也是最容易治愈的一种。如果使其发展至 蔓延到其它位点的程度，则预后很差。目前每年出现多于8000例黑素瘤死亡。
[0006] 黑素瘤是黑素细胞的恶性肿瘤。黑素细胞主要存在于皮肤、皮肤的外层（表皮）和 下一层（真皮）之间，但其也在身体的其他部分发现，包括肠和眼部（参见葡萄膜黑素瘤）。 黑素瘤可在身体包含黑素细胞的任何部位或作为未知的原发病灶的转移性肿瘤发生。黑素 瘤相比其他皮肤癌较不常见但其危险得多并引起与皮肤癌相关的死亡的大多数（75% )。
[0007] 黑素瘤源于对黑素细胞的DNA损伤。该疾病的早期通常始于将肿瘤限制在表皮的 径向生长期，然后是真皮的"垂直生长期"（VGP)。一些黑素瘤获得进一步的侵入潜力，生长 入周围的组织并可能通过血液或淋巴管蔓延到身体各处以形成转移。
[0008] 在VGP过程中针对肿瘤的免疫反应可通过肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL)的存在和活 性来判断。这些细胞有时攻击原发肿瘤，且在某些情况中，原发肿瘤随只有转移性肿瘤的诊 断消退（regress) 〇
[0009] 多重遗传事件已与黑素瘤的发病机制（疾病进展）相关。一些黑素瘤病例具有清 楚的遗传素因。在⑶KN2A、⑶K4、MC1R、MDM2 SNP309和与着色性干皮（XP)相关的基因中 的种系突变使患者易患黑素瘤。家族性黑素瘤的其他情况是遗传异质性的，且已在染色体 臂lp、9p和12q上鉴定针对家族性黑素瘤的推定基因座。
[0010] 临床和病理诊断
[0011] 黑素瘤首先通常通过对皮肤色素病变的目视检查检测，值得注意的是显示以下的 那些：(A)不对称性，（B)不均匀、参差不齐或有缺口的边界，（C)不同深浅的棕色，黑色或棕 褐色的颜色和（D)近期大小上变化的直径。相反，非肿瘤性的色素痣（moles)或痣（nevi) 是对称的，具有常规边界，甚至着色，并随时间不显示大小/直径的变化。诊断主要关注的 是在良性痣、可随时间显示进展的发育异常的痣和黑素瘤间进行区分。颜色和形状不规则 的色素痣接受进一步针对黑素瘤的病情检查。通过目视检查和镜下皮肤检查或体内诊断工 具如共聚焦显微镜，通常获得可疑的色素痣的样品（活检）。
[0012] 样品制备
[0013] 当已鉴定非典型色素痣时，进行皮肤活检以对其进行最佳诊断。使用局部麻醉以 使该区域麻木，随后对所述色素痣进行活检。随后将活检材料送至实验室由病理学家进行 评估。皮肤活检可以是打孔或刮样活检，或完全切除。完全切除是优选的方法，但如果患者 具有美容上的顾虑（即所述患者不想要疤痕）且病灶/损害（lesion)较小，则打孔活检也 可满足。由于横切黑素瘤且由此损失重要的预后信息的风险，因此通常应避免铲或深刮活 检。
[0014] 大多数皮肤科医生和皮肤病理学家基于病灶/损害如何对称和黑素细胞中细胞 学非典型的程度使用诊断方案用于对黑素细胞/损害分类。在该分类中，将痣分类为明确 良性、非典型/发育异常或明确黑素瘤。良性痣不展示明显的细胞学非典型并对称生长。 可认为非典型的痣具有非对称生长和/或具有（温和的、适度的或严重的）细胞学非典型。 通常，细胞学非典型相比结构非典型引起更重要的临床顾虑。与黑素瘤一起，具有适度和严 重细胞学非典型的痣可能需要进一步切除以确保手术切缘是病灶/损害的彻底清除。
[0015] 黑素瘤的皮肤活检报告的重要方面包括样式（pattern)(原位组分、径向或垂直 生长的存在/不存在）、侵入深度、淋巴细胞浸润的存在、血管或淋巴管侵入的存在/不存 在、先前存在的良性黑素瘤的存在/不存在和有丝分裂指数。针对非典型痣和黑素瘤皮肤 活检报告的其他重要方面是对于病理学家指示切缘是否清除了肿瘤。如果在边缘存在任何 非典型黑素细胞或如果确诊黑素瘤，则实施再次切除。也可基于在初始生物活检和再次切 除所见的肿瘤参数实施淋巴结切除。
[0016] 可对黑素瘤生物活检、再次切除或淋巴结转移样品实施进一步的分子测试以对可 靶向的遗传改变进行评估来帮助选择最佳疗法。
[0017] BRAF
[0018] BRAF是产生称为B-Raf蛋白的人基因。还将该基因称作原癌基因 B-Raf和v-Raf 鼠类肉瘤病毒原癌基因同源物B1，而蛋白则更正式称为丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶B-Raf。 B-Raf是丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶的Raf激酶家族成员。该蛋白在调节MAP激酶/ ERK信号传导途径中发挥作用，其影响细胞分离、分化和生长因子表达。
[0019] 在2002年，BRAF在人癌症中显示突变。已鉴定了多于30种与人癌症相关的BRAF 基因的突变。BRAF突变的频率在人癌症中广泛变化，从黑素瘤和一些良性痣类型中的约 60%至常见癌症如肺腺癌（ACA)和结肠直肠癌中的约1-10%。在90%的BRAF突变的肿瘤 中，在核苷酸1799处的胸腺嘧啶取代为腺嘌呤。这导致激活片段中在密码子600处的缬氨 酸（V)由谷氨酸（E)取代（V600E)。在乳头状甲状腺癌、结肠直肠癌、黑色素瘤和非小细胞肺 癌中已广泛观察到该突变。在2011年六月，意大利的科学家团队使用了大规模平行测序在 毛发细胞白血病的100%病例中查明突变V600E为可能的驱动突变。比较少见的是，V600E 突变还可通过双核苷酸取代发生。
[0020] 已发现的 BRAF 突变为 R462I、I463S、G464E、G464V、G466A、G466E、G466V、G469A、 G469E、N581S、E586K、D594V、F595L、G596R、L597V、T599I、V600D、V600E、V600K、V600R、 K601E、E602K和A728V等。这些突变大多聚集在基因的两个区中：N叶（lobe)的甘氨酸富 集P环和活化区段和侧翼区。这些突变的许多使活化区段从失活状态变为活化状态。例如， 在V600突变中，P环中的Val600的脂肪族侧链与Phe467的苯环相互作用。用更大的带电 残基替换中等大小的疏水Val侧链（如在人肿瘤中发现的Val至Glu、Asp、Lys或Arg的变 化）可使在失活构象中维持DFG基序的相互作用变得不稳定，导致活性位置中的构象位移。 每种BRAF激酶突变对MEK磷酸化活性具有不同影响，其中多数突变相比未突变的B-Raf蛋 白具有更高的磷酸化活性，但一些突变显示降低的或者甚至不存在的激酶活性，称为"抑制 性" BRAF突变。这些抑制性突变的影响表现为激活野生型C-Raf，其随后传递信号至ERK。
[0021] BRAF还已成为用于肿瘤治疗的重要药物靶标。已开发治疗由BRAF突变驱动的癌 症的药物。2011年8月17日，其中之一维罗非尼由FDA批准用于治疗晚期黑素瘤。其他 BRAF-定向的激酶抑制剂包括⑶C-0879、PLX-4720、苯磺酸索拉非尼、达拉非尼和LGX818。
[0022] DDR2
[0023] 盘状结构域受体家族成员2,还称为DDR2或⑶167b (167b分化簇），是响应胞外信 号调节细胞生长、分化和代谢的受体酪氨酸激酶（RTK)。先前已在3-4%的肺的鳞状细胞癌 (SCC)中报道DDR2突变。在肺SCC中，已显示具有DDR2突变的数个病例对用酪氨酸激酶抑 制剂达沙替尼之治疗具有临床响应（Cancer Discov. 2011 April 3 ;1 (1):78-89)。数据表 明DDR2可以是SCC中的重要治疗靶标。
[0024] DDR2蛋白包含胞外盘状（DS)结构域、跨膜结构域和激酶结构域。激酶结构域位 于全长蛋白（其包含信号肽）的氨基酸563至849而DS结构域位于氨基酸22-399。人 DDR2mRNA变体2的核苷酸序列显示于GenBank登录号NM_006182。
[0025] 发明概述
[0026] 公开了在个体中诊断黑素瘤的方法。在本发明的一方面，在个体中诊断黑素瘤的 方法包括：
[0027] (a)分析来自所述个体的生物样品，
[0028] (b)检测所述样品中编码具有选自下组的突变的DDR2蛋白的核酸的存在：R105C、 P321L、R458H、S467F、P476S、I488S、F574C、S667F、S674F、R680L、L701F、R742Q 和 T836A，和
[0029] (C)当检测到所述突变时，将所述个体诊断为患有黑素瘤，由此指示所述个体患有 黑素瘤。
[0030] 另一方面，一种在个体中诊断黑素瘤的方法包括：
[0031] (a)分析来自所述个体的生物样品，
[0032] (b)检测所述样品中具有选自下组的突变的DDR2蛋白的存在：R105C、P321L、 R458H、S467F、P476S、I488S、F574C、S667F、S674F、R680L、L701F、R742Q 和 T836A，和
[0033] (c)当检测到所述突变时，将所述个体诊断为患有黑素瘤，由此指示所述个体患有 黑素瘤。
[0034] 在具体的实施方案中，所述黑素瘤是晚期黑素瘤。所述个体可具有皮肤病灶/损 害和/或可疑似具有皮肤病症如，例如皮肤癌或黑素瘤。
[0035] 还公开了在个体中诊断基底细胞癌的方法。本发明的一方面，在个体中诊断基底 细胞癌的方法包括：
[0036] (a)分析来自所述个体的生物样品，
[0037] (b)检测所述样品中编码具有选自下组的突变的DDR2蛋白的核酸的存在：N146K、 R399Q和 S702F，和
[0038] (c)当检测到所述突变时，将所述个体诊断为患有基底细胞癌，由此指示所述个体 患有基底细胞癌。
[0039] 本发明的另一方面，在个体中诊断基底细胞癌的方法包括：
[0040] (a)分析来自所述个体的生物样品，
[0041] (b)检测所述样品中具有选自下组的突变的DDR2蛋白的存在：N146K、R399Q和 S702F，和
[0042] (C)当检测到所述突变时，将所述个体诊断为患有基底细胞癌，由此指示所述个体 患有基底细胞癌。
[0043] 个体可具有皮肤病灶/损害和/或可疑似具有皮肤病症如例如皮肤癌或黑素瘤。
[0044] 还公开了用于判断患有黑素瘤或基底细胞癌的个体将对用激酶抑制剂的治疗响 应的可能性的方法，其包括：
[0045] (a)分析来自所述个体的生物样品，
[0046] (b)检测所述样品中的DDR2核酸或蛋白中赋予对激酶抑制剂的敏感性的DDR2突 变的存在，和
[0047] (c)当一种或多种所述DDR2突变存在时，将所述个体鉴定为其可能对用激酶抑制 剂的治疗响应，由此指示所述个体可能对用激酶抑制剂的治疗响应。
[0048] DDR2 突变可以是选自下组的 DDR2 蛋白突变：R105C、P321L、R458H、S467F、P476S、 I488S、F574C、S667F、S674F、R680L、L701F、R742Q 和 T836A，或所述 DDR2 突变是编码选自 下组的具有突变的 DDR2 蛋白的核酸：R105C、P321L、R458H、S467F、P476S、I488S、F574C、 S667F、S674F、R6