一种香型可可育种材料的鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物信息技术领域，具体的说是设及一种香型可可育种材料的鉴定方 法。
【背景技术】
[0002] 可可（TheobromacacaoL.)又称巧克力树，为热带重要的多年生经济作物，与茶 叶、咖啡并称为"世界=大饮料作物"。其种子富含脂肪、多酪、黄酬类化合物和膳食纤维等 活性成分，具有改善屯、脏、肾脏、肠道功能、缓解屯、绞痛、促进消化、治疗贫血等保健作用，是 制作巧克力、高级饮品、糖果、糕点和冰洪淋等主要原料。作为一种深受人们喜爱的饮料食 品和具有重要用途的热带农产品，长期W来存在需求旺盛与供应不足的问题。近年来，世界 可可豆年产量约500万吨，其产品出口量为494. 9万吨，贸易额达139亿美元。随着生活水 平不断提高和饮食结构变化，可可的需求量还将大幅增加。可可已成为发展中国家热区农 业经济收入的特殊组成，对发展热带经济，提高边远地区农民收入和生活水平具有重要意 义。
[0003] 目前，国际可可贸易市场将可可豆分为普通级度ulkcocoa,BC)和香型级（Fine cocoa,FC)两类，后者具有明显的"花香"和"果香"风味，且其市场价格是普通豆的140%。 然而，世界香型可可豆年产量仅16万吨，约占可可总产量的4%，香型可可原料的供需 矛盾极为突出。据国际可可组织市场调研报告显示，仅厄瓜多尔、秘鲁、哥伦比亚、墨西 哥、己布新几内亚等8个国家生产香型可可，且品种香气品质受地域限制性极强。比如， 哥伦比亚出口的香型可可品种为化iollo,年产量仅为42. 2吨；多米尼加出口的香型可 可品种为化spaniola化initario,年产量仅为54. 0吨；墨西哥出口的香型可可品种为 arriba化cional、Xoconusco化iollo,年产量为21.0吨；委内瑞拉出口的香型可可品种 为化iollo和Trinitario,年产量仅为18. 0吨。目前，全球香型可可供给量W厄瓜多尔的 arriba化cional品种为主，占世界香型可可产量的75%，但品种间杂交导致品质退化，约 1/4产量被列入普通级可可。同时，不法商贩在香型可可豆中渗杂普通级豆的现象屡见不 鲜，严重制约了可可市场的良性发展。因此，香型可可新品种的选育成为产业发展的迫切需 要。而获得优异性状的香型可可育种材料是提高优质可可育种效率的充要条件。
[0004] 可可为热带木本经济作物，其杂交育种新品种选育周期在10年W上。在杂交亲 本的选配中，如果对育种材料的性状鉴定不准确，往往会使育种成效进展缓慢，甚至劳而无 功。尤其在香型可可品种选育种中该问题更为突出，主要表现在（1)香型育种材料缺乏、 资源混杂，如目前世界主栽的香型可可品种是厄瓜多尔的arriba化cional，其次为秘鲁的 化cional，在香型遗传资源上表现为遗传基础狭窄；目前，可可栽培品种均是由其S大遗传 类群Criollo,F'orastero和Trinitario中演化而来，但因Criollo、Trinitario遗传类群 与Forastero遗传类群的香味差异很大，有时人们常将化iollo和Trinitario遗传类群 笼统地归为香型可可。运在一定程度上扩大了香型可可品种的范畴，而将普通可可品种错 误地归为香型可可品种，在市场上容易造成渗假问题。如厄瓜多尔的arriba化cional品 种属于化rastero遗传类群，而非化iollo和化initario遗传类群；（2)香型可可与普通 可可鉴定难度大、周期长，准确性低，如厄瓜多尔的arriba化cional品种是厄瓜多尔本± 生长的味觉独特的香型可可，该品种是自然杂交的结果，因其独特的"果香"、"花香"味觉， 被定义为香型可可。目前，国际可可市场香型可可75%供给量都是该品种，因此，该品种是 香型可可的典型代表。秘鲁的化cional品种，该品种生长在秘鲁的马拉尼峡谷（Maranon Canyon),为当地农户栽培种植的农家种，但是直到2011年美国农业部扣SDAAR巧对秘鲁 可可资源考察时，才发现秘鲁的化cional品种属于香型可可，且该品种曾被错误地鉴定位 厄瓜多尔的arriba化cional品种。综上所述，目前，香型可可品种很少，而判断与普通可可 的区别，多依靠栽培地域来源、品种属=大遗传类群的哪一类别及其长期从事可可工作的 经验来判断（具有运种经验的人并不是很多，也就是说靠经验判断的方法不具有普遍性）， 尚缺乏科学的可可香味品质的精确鉴定技术，给可可杂交育种中香型可可育种材料的准确 选配造成很大困难。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于一种准确度高、周期短、简便的香型可可育种材料的 鉴定方法，为香型可可品种的鉴定和选育提供科学的依据和指导。
[0006] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0007] -种香型可可育种材料的鉴定方法，包括
[0008] 步骤1、将未经发酵和烘赔的至少4种已知香型可可和至少4种已知普通可可，采 用顶空固相微萃取方法分别富集其中的香气成分，利用GC/MS技术进行香气成分的检测分 析；
[0009] 步骤2、利用GC/MS获得香气成分出峰时间、含量、强度及其分子量大小信息，在 GC/MS系统数据库NIST2008中鉴定出相匹配的香气物质，同时测定其相同升溫程序下的 Kovats保留指数辅助鉴定香气物质；
[0010] 步骤3、将步骤1和步骤2中GC/MS系统获得的香气成分信息转化为"mX化+n)" 矩阵，m代表鉴定获得的香气物质数量总和，K代表各香气物质的Kovats保留指数，n代表 共n个已知香型可可与已知普通可可样品的各香气物质的含量；
[0011] 步骤4、待测的未知可可按照步骤2、步骤3的方法，将其GC/MS香气成分信息全部 转化后，汇编入步骤3所形成的"mX化+n)"矩阵，形成"mX化+ (n+x))"矩阵，X代表X个 未知可可的的各香气物质的含量；然后，通过计算X个待测未知可可样品与共n个已知香型 可可和已知普通可可样品之间的香气组成平均欧氏距离，并利用组间平均距离法进行聚类 分析，获得未知可可和已知香型可可W及已知普通可可香气组成的聚类分析谱系图，从而 判别X个待测可可样品是否属于香型可可。
[0012] 本发明为解决香型可可新品种选育中香型育种材料鉴定难度大、周期长、准确性 低等鉴定技术问题，采用顶空固相微萃取方法分别富集已知香型可可品种与普通可可品种 中的香气成分，利用气相色谱一质谱联用（GC-M巧技术进行香气成分的检测分析，筛选出 香型可可品种的特征香气因子，提供一种基于GC-MS技术的香型可可育种材料鉴定方法。
[0013] 其中，作为优选，所述已知香型可可数量为4种，普通可可数量为4种；或已知香型 可可数量为4种，普通可可数量为5种；或已知香型可可数量为5种，普通可可数量为6种； 或已知香型可可数量为5种，普通可可数量为7种。
[0014] 作为优选，所述未经发酵和烘赔的已知香型可可和已知普通可可的含水量均低于 8%。
[0015] 作为优选，所述固相微萃取方法具体步骤为：
[0016] 选择二乙締基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷固相微萃取纤维头，使用前将固相 微萃取纤维头在气相色谱的进样口老化；
[0017] 准确称取已粉碎的可可样品，置于萃取瓶底部，水浴加热，用老化后的固相微萃取 纤维头通过聚四氣乙締瓶垫插入到萃取瓶中，置于可可样品正上方进行顶空萃取。
[0018] 更优选地，所述固相微萃取方法具体步骤为：
[0019] 选择50/30ym、二乙締基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷固相微萃取纤维头；使 用前将固相微萃取纤维头在气相色谱的进样口老化，老化溫度250°C，老化时间30min;
[0020] 准确称取2.OOg已粉碎的可可样品，置于15ml萃取瓶底部，于60°C水浴中加热 30min，用老化后的固相微萃取纤维头通过聚四氣乙締瓶垫插入到萃取瓶中，置于可可样品 正上方0. 5cm左右，顶空萃取15min。
[0021] 作为优选，所述利用GC/MS技术进行香气成分的检测分析具体为：
[0022] 采用顶空固相微萃取方法富集的香气成分，即富集香气成分的固相