析膜上包含有质控C线，检测Tl线和检测T2线，质控线和检测线均位于卡板的检测窗口内。C线固定有羊抗鼠的IgG的多克隆抗体。Tl线含有另一个腺病毒(ADV)抗体，T2线含有另一个合胞病毒(RSV)抗体。
[0042]试剂板3的试剂条上的结合垫固定有荧光标记的副流感I (HPIVl)单克隆抗体、荧光标记的副流感II (HPIV2)单克隆抗体、荧光标记的副流感III (HPIV3)单克隆抗体。层析膜上包含有质控C线，检测Tl线，检测T2线和检测T3线，质控线和检测线均位于卡板的检测窗口内。C线固定有羊抗鼠的IgG的多克隆抗体。Tl线含有另一个HPIVl抗体，T2线含有另一个HPIV2抗体，T3线含有另一个HPIV3抗体。
[0043]使用本实施例中的七项呼吸道病原体检测试剂盒检测待测样本，操作过程如下: 1.取咽拭子样本0.5ml，加入样本管中，然后分别加入0.5ml的样本抽提液，反复挤压样本管数次，使咽拭子样本中病原体尽可能多的释放到样本抽提液中，并且充分混匀样本。
[0044]2.在七联检试剂板上的加样孔中，分别滴加10ul (3滴)的待测样本液，等待5_15min0
[0045]3.将反应后的试剂板，插入荧光免疫分析仪中，开始检测。仪器的检测波段为激发光波长365nm，发射光波长610nmo
[0046]本实施例中病原体检测试剂盒(免疫荧光法)的最小检测灵敏度为:
FluA 彡 3X104 TCID50/0.1ml
FluB ( 3.15 X 14 TCID50/0.1mlADV 彡 1.0X104VP/ml (VP:病毒粒子数)
RSV ( 1.2X104TCID50/mlHPIVl ^ 2.50 X 14 TCID50/mlHPIV2 ( 2.50 X 14 TCID50/mlHPIV3 ^ 8.0OXlO4 TCID50/ml。
[0047]本实施例中产品的特异性大于99%，交叉反应试验确认，本试剂与18种细菌和真菌、21种病毒及衣原体均没有交叉反应。
[0048]在患者感染的初期(2-3天左右)，仅有少量的病原体时。而本试剂盒较高的特异性和灵敏度，能够准确判断病原体的阳性感染情况，在感染初期即可确定是否感染病原体，为治疗提供依据。
[0049]使用本发明的多项呼吸道病原体试剂盒可以同时检测多项呼吸道病原体，也可以将上述试剂板拆开，成为单一病原体试剂板或者两种病原体检测试剂板，同时检测一种或者两种病原体。
[0050]比较例:
贝西-七项呼吸道病原体检测试剂盒(免疫荧光法)。
[0051]操作步骤如下:
1.将待检测样本(以咽拭子样本为例)在涡旋振荡仪上震10-15秒，使其充分混匀。将混匀的待测样本离心，在室温下，1000转/分钟，离心lOmin。离心完成后弃上清。然后再加l_2ml的磷酸缓冲液(PBS)，震荡混匀后，再次离心lOmin，弃上清。加入0.5ml的PBS，充分震荡混匀，形成细胞悬浊液。
[0052]2.将处理好的待测样本，滴加在载玻片上。每个载玻片上的七个加样孔各滴加一滴(约25ul)待测样本。
[0053]3.然后烘干样本，在恒温箱中，37 °C条件下，烘干约30min。
[0054]4.取出烘干的载玻片，在预冷的100%丙酮中固定细胞20-30s，取出，自然风干。
[0055]5.在风干的细胞上，滴加DFA细胞染色试剂。同一片载玻片上的七个孔，对应滴加七种DFA细胞染色剂。试剂用量以完全覆盖细胞为准，一般一滴约20-30ul。
[0056]6.然后，将染色的载玻片放置到恒温箱中，37 °C，孵育约30min。
[0057]7.孵育完成的载玻片，在稀释好的洗液(PBS缓冲液)中漂洗3min以上，至少需漂洗两次。然后用去离子水清洗3min。
[0058]7.清洗完成的载玻片上滴加一滴甘油，并加盖盖玻片。
[0059]8.在暗室的焚光显微镜下检测。焚光显微镜的激发光波长490nm，发射光波长520nmo
[0060]检测结果如图2所示:只能定性观察是否有病毒感染组织细胞。
[0061]灵敏性和特异性检测:
灵敏度:平均能检测出的病毒的最低浓度为1.0PFU。
[0062]特异度:89.7%_100%，用筛查和鉴定试剂对多种细胞和微生物进行交叉反应测试，对64种病毒、18种细胞、19种细菌均没有交叉反应。
[0063]本发明虽然已以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定本发明，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以利用上述揭示的试剂盒和技术内容对本发明技术方案做出可能的变动和修改，因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。
【主权项】
1.多项呼吸道病原体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括样品抽提液，样品管，多联检试剂板； 每个多联检试剂板包括连接板和至少一个单一试剂板； 单一试剂板包括卡板和试剂条，试剂板的外壳为卡板，试剂条位于卡板内部； 卡板的一端设有连接部，连接部与连接板可拆卸连接； 卡板上表面设有加样孔和检测窗口； 每个试剂条包括PVC板，层析膜，样品垫，结合垫和吸水材料； 卡板上的加样孔位于样品垫之上， 每个试剂条的结合垫上固定有至少一种荧光标记的呼吸道病原体的单克隆抗体，层析膜上包含有质控C线，至少一条检测T线，质控线和检测线均位于卡板的检测窗口内，C线固定有羊抗鼠的IgG的多克隆抗体，每条T线均含有一种与结合垫上荧光标记抗体相对应的抗体。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒还包括样品管支架和棉签。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，卡板的连接部为一凹槽，所述凹槽设置在卡板一端的侧表面上；连接板设有与凹槽相对应的凸起。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述连接板的凸起长度为凹槽长度的至少一倍。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，样品抽提液为磷酸缓冲液Tris缓冲液、硼酸缓冲液中的一种。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述样品抽提液中含有质量分数1%的表面活性剂TritonX-1OO07.一种多项呼吸道病原体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤a，采取待测样本； 步骤b，使用如权利要求1所述的试剂盒，将取出的样品放入样品管中，并加入样品抽提液混合均勾; 步骤C，分别在每个单一试剂板的加样孔中滴加步骤b中混合均匀的待测样品液进行反应；也可根据待测病原体的种类选取相应数目的试剂板单独检测； 步骤d，将反应后的试剂板插入荧光免疫分析器中进行检测，得到检测结果。8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤b中加入的样品抽提液体积与样品体积比为1:1。9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤d中使用免疫荧光分析仪器的检测波段为激发光波长365nm，发射光波长610nm。
【专利摘要】本发明提供了一种多项呼吸道病原体检测试剂盒及检测方法，多项呼吸道病原体检测试剂盒包括样品抽提液，样品管，多联检试剂板；每个多联检试剂板包含连接板和至少一个单一试剂板；单一试剂板包括卡板和试剂条；卡板的一端设有连接部，连接部与连接板可拆卸连接；卡板上表面设有加样孔和检测窗口；每个试剂条包括PVC板，层析膜，样品垫，结合垫和吸水材料；每个结合垫上面固定至少一种荧光标记的待测呼吸道病原体相应的抗体，每个层析膜上包含质控线C和至少一条检测线T，T线固定有一种相应待测呼吸道病原体对应的抗体，C线固定有羊抗鼠的IgG的多克隆抗体。本发明的试剂盒操作简单，方便快捷；检测用时短；检测特异性强；灵敏度高。
【IPC分类】G01N33/558
【公开号】CN105116143
【申请号】CN201510493624
【发明人】陈功祥, 厉永钢, 伍传丽, 朱芳宏, 黄东, 胡小芳, 汪文君
【申请人】杭州创新生物检控技术有限公司
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年8月12日