一种采用hplc法测定桑葚药材中柠檬酸含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药质量检测领域，尤其涉及一种HPLC法测定桑葚药材中柠檬酸含 量的方法。
【背景技术】
[0002] 桑椹，又名桑椹子、桑果、桑子、是桑科桑属mulberry (Morus alba L.)植物的果 实。本属植物全球约有16种，分布于北温带、亚洲热带和非洲热带及美洲地区。我国约有 11种，分布于全国大部分地区，以江苏、浙江等南方养蚕地区产量较大。1993年国家卫生部 把桑椹列为"既是食品又是药品"的农产品之一。
[0003] 桑椹中含有丰富的糖类、有机酸、脂类、维生素、色素、非色素酚和矿物质等成分。 目前，在桑椹营养成分的研究的基础上，国内外对桑椹中功效成分的研究较多，主要集中在 桑椹色素、非色素酚、及多糖等成分上。柠檬酸是其中含量较高的有机酸，柠檬酸又名枸橼 酸，易溶于水，其具广泛的药理作用：1)柠檬能防止心血管动脉硬化并减少血液粘稠度；2) 中国中医认为，柠檬性温、味苦、无毒，具有止渴生津、祛暑安胎、疏滞、健胃、止痛等功能利 尿，调剂血管通透性；3)柠檬酸热量低，且具有很强的收缩性，因此有利于减少脂肪，是减 肥良药；4)具有防止和消除皮肤色素沉着的作用；5)祛痰作用等。因此，建立起一种准确测 量桑椹药材中柠檬酸含量的方法对于桑葚药材的质量控制具有重要意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种采用HPLC方法测定桑葚药材中柠檬酸含量的方法，包 括如下步骤：
[0005] (1)制备对照品溶液
[0006] 称取柠檬酸对照品，加水制成浓度为1. 70-1. 73mg · ml 1的溶液，即得；
[0007] ⑵制备供试品溶液
[0008] 称取桑葚药材样品，配制成浓度为15-25mg · ml 1的水溶液，即得；
[0009] (3)色谱条件
[0010] 色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相为0. 1 % -1. 0%的磷酸水溶 液；
[0011] ⑷测试
[0012] 所述测试包括两步，第一步绘制标准曲线，包括如下步骤：将所述的对照品溶液稀 释成浓度范围为0. 1-2. Omg · mL 1的待测对照品溶液5-7个，按照上述色谱条件，分别测定 待测对照品溶液以及对照品溶液的峰面积，然后以峰面积为纵坐标，柠檬酸的质量浓度为 横坐标进行线性回归，得到回归方程；
[0013] 第二步测定供试品溶液，按照上述色谱条件，测定供试品溶液的峰面积，根据回归 方程，得到供试品溶液的柠檬酸含量。
[0014] 作为本发明优选的方案，所述的色谱条件为采用Kromasil C18 (250mmX4. 6mm， 5 μ m)色谱柱；流动相为0. 6 %的磷酸水溶液。
[0015] 发明人考察了 1. 0%醋酸与0. 6%磷酸2种系统梯度洗脱及其不同流动相比例，比 较的磷酸浓度有〇. 1 %，〇. 3 %，0. 6 %，I. 0 %水溶液。结果表明，各种流动相中0. 6 %磷酸水 溶液系统为最佳，其图谱上各个色谱峰的分离度较好，保留时间适中。
[0016] 作为本发明更加优选的方案，所述的色谱条件还包括：采用紫外检测器，检测波长 为 200-240nm，流速：0· 3-L 5ml · min S柱温：25-40°C ;进样量 5-20 μ 1。
[0017] 作为本发明最优选的方案，所述的色谱条件为：色谱柱为Kromasil (：18(25〇11111^4.6111111，5 4111);流动相：0.6%的磷酸水溶液，检测器：紫外，检测波长 ：20911111， 流速：0· 5mL · min \ 柱温：30°C，进样量 10 μ 1。
[0018] 发明人同时比较了不同柱温与流速的影响，柱温超过30°C分析时间缩短，但大多 数色谱峰分离度小或不能分开；流速低于0. 5ml · min \分析时间过长，高于0. 5ml · min 1 大多数色谱峰分离度差。因此选择便于控制的柱温30°C与流速0. 5ml · min 1作为色谱条 件。
[0019] 作为本发明最优选的方案，步骤（2)中，称取桑葚药材样品之前，先将样品粉末过 4号筛。
[0020] 作为本发明最优选的方案，步骤（2)中，将称量好的桑葚药品加入蒸馏水中，加热 回流提取〇. 5-1. 5h，优选为lh。
[0021] 发明人比较了用水作为溶剂超声提取与用水作为溶剂加热回流提取来进行供试 品溶液制备的区别，结果表明，用水作为溶剂加热回流提取得到的峰面积较大、峰个数较 多、分离度较好，所以选择用加热回流的方式提取。
[0022] 作为本发明优选的方案，步骤（4)中，所述的待测对照品溶液的浓度分别为 0· 10320、0· 17200、0· 34400、0· 68800、L 37600mg · ml \ 据此测得的回归方程为 y = 1278680X+1614,相关系数r为0. 9999,其线性关系良好。
[0023] 作为本发明最优选的方案，本发明提高一种采用HPLC方法测定桑葚药材中柠檬 酸含量的方法，包括如下步骤：
[0024] (1)制备对照品洛液
[0025] 称取柠檬酸对照品，配制成浓度为17. 2000mg · ml 1的水溶液，超声并摇匀，过滤， 取过滤液，即得对照品溶液；
[0026] (2)制备供试品溶液
[0027] 将桑葚药品粉末过4号筛，配制成浓度为15-25mg · ml \优选为2〇-22mg · ml 1的 水溶液，加热回流提取lh，过滤，取过滤液，即得供试品溶液；
[0028] (3)色谱条件
[0029] 色谱柱为Kromasil C18 (250_X4. 6_，5 μ m);流动相：0· 6 %的磷酸水溶液，检 测器：紫外，检测波长：209nm，流速：0. 5mL · min \柱温：30°C，进样量10 μ 1。
[0030] ⑷测试
[0031] 所述测试包括两步，第一步绘制标准曲线，包括如下步骤：将所述的对照品溶液稀 释成浓度分别为 〇· 1〇320、0· 17200、0· 34400、0· 68800、L 37600mg · ml 1的 5 个待测对照品 溶液，按照上述色谱条件，分别测定5个待测对照品溶液以及浓度为I. 72000mg · ml 1的对 照品溶液的峰面积，然后以峰面积为纵坐标，柠檬酸的质量浓度为横坐标进行线性回归，得 到回归方程y = 1278680x+1614,相关系数r为0. 9999。
[0032] 第二步测定供试品溶液，按照上述色谱条件，测定供试品溶液的峰面积，根据回归 方程，得到供试品溶液的柠檬酸含量。
[0033] 本发明具有的优点和有益效果是：通过测定不同产地桑椹药材中柠檬酸成分的含 量，表明该方法稳定可靠，单用液相色谱仪即可，避开了液相色谱与质谱连用的限制，使检 测简单化；由于桑椹药材中的柠檬酸含量较高，且作用广泛，可用于桑椹药材的质量控制。
【附图说明】
[0034] 图1是柠檬酸对照品的色谱图。
[0035] 图2是江苏产地供试品的色谱图。
[0036] 图1中柠檬酸的出峰时间为22. 369min ;
[0037] 图2中柠檬酸的出峰时间为22. 477min。
【具体实施方式】
[0038] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0039] 本发明涉及到的仪器为：岛津高效液相色谱仪（Prominence UFLC)，日本岛津公 司；1/10万电子分析天平，型号ME235S，德国塞多利斯公司；电热套（1000ml)，上海科析实 验仪器厂；KQ-300DE数控超声波发生器，昆山超声仪器有限公司。
[0040] 本发明涉及到的药品为：磷酸，AR级，天津市富宇精细化工有限公司；水，自制；枸 橼酸（批号111679-200401)对照品，购自中国食品药品检定研究院；桑椹药材：安徽产地 (批号 20150412、20150415)，新疆药材（批号 20150418、20150419、20150421)，较广产地批 号（20150422)，河南产地（批号20150508)，江苏产地（批号20150428)，四川产地（批号 20150502)，陕西产地（批号20150427)由陕西君碧莎制药有限公司提供。
[0041] 实施例1
[0042] (1)色谱条件：色谱柱为Kromasil C18(250_X4. 6mm，5 μπι);流动相：0· 6%