一种基于立方钯-八面氧化亚铜-氧化石墨烯构建的t-2毒素传感器的制备方法及应用
【技术领域】
[0001]本发明一种立方钯-八面氧化亚铜-氧化石墨烯构建的T-2毒素传感器的制备方法及应用。具体是采用具有良好电化学催化性能的立方钯-八面氧化亚铜-氧化石墨烯，制备一种检测粮食中T-2毒素的传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。
【背景技术】
[0002]1973年联合国粮农组织和世界卫生组织在日内瓦召开的联席会议上，把这类毒素同黄曲霉素一样作为自然存在的最危险的食品污染源，尤其是美国指责前苏联、越南在东南亚使用“黄雨”毒素(其中含有T-2毒素)以后，有关T-2毒素对人类健康的危害引起了各国科学家的较大关注，近几年来国外对T-2毒素开展了较多的研究。
[0003]目前生物传感器已经广泛用于各种真菌毒素的检测，因为生物传感器具有灵敏度高、选择性好、结构简单、操作简便、易于小型化、可连续、快速自动化检测分析等一系列优点。其中，由于无标记型传感器可以直接用于检测抗原抗体的识别过程并且避免了标记物带来的干扰，得到了更加广泛的关注。
[0004]本发明将立方钯-八面氧化亚铜-氧化石墨烯修饰到玻碳电极表面，构建无标记型传感器。第一，立方钯-八面氧化亚铜-氧化石墨烯中的立方钯具有良好的生物相容性，并且能够有效地固定抗体；第二，立方钯-八面氧化亚铜-氧化石墨烯中的立方钯和八面氧化亚铜都具有良好的电化学催化活性，能够提高传感器的灵敏度；第三，立方钯-八面氧化亚铜-氧化石墨烯中的氧化石墨烯具有良好的电子转移能力和大的比表面积，能够进一步增加抗体的固定和增强电子传递。该方法在检测过程中产生了良好的电化学信号，可用于T-2毒素的分析。该方法具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，而且制备过程较为简单，为目前有效检测T-2毒素提供了新途径。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一是基于立方钯-八面氧化亚铜-氧化石墨烯构建无标记型生物传感器。
[0006]本发明的目的之二是将该无标记型生物传感器应用于T-2毒素的高灵敏、特异性检测。
[0007]本发明的技术方案如下
1.一种基于立方钯-八面氧化亚铜-氧化石墨烯构建的T-2毒素传感器的制备方法
(1)依次用1.0,0.3,0.05 Pm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
(2)在电极表面滴加6μ L浓度为I ~ 2 mg/mL的立方钯-八面氧化亚铜-氧化石墨烯水溶液，干燥；
(3)继续将6PL浓度为5 ~ 20 Pg/mL的Τ-2毒素抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4 °C冰箱中孵化I h，清洗干净；
(4)用3yL浓度为5 ~ 20 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4°C冰箱中孵化I h，清洗干净；
(5)将6μ L浓度为0.0001 ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的Τ-2毒素抗原用于和抗体的特异性识别，室温下孵化I h，清洗干净，于4°C冰箱中储存备用。
[0008]立方钯-八面氧化亚铜-氧化石墨烯的制备
(1)立方钯的制备
将105 mg聚乙稀卩比略烧酮、60 mg抗坏血酸和溴化钾600 mg溴化钾加入到4 ~ 12 mL水溶液中，在80°C条件下持续搅拌10 min后，加入1.5 ~ 6 mL含有57 mg的四氯钯酸钠，继续反应3 h，离心洗涤后，重新分散在5.5 ~ 22 mL水中，得到立方钯溶液；
(2)八面氧化亚铜的制备
将I g氯化亚铜溶解在含有6 mol/L氯化钠的50 ~ 200 mL水溶液中，将其和10 ~40 mL的0.6 mol/L磷酸钠溶液同时加入到50 ~ 200 mL水中，随后在60°C条件下搅拌20min，离心洗涤后干燥，得到八面氧化亚铜；
(3)立方钯-八面氧化亚铜-氧化石墨烯的制备
将0.1 g八面氧化亚铜和0.1 mL三氨丙基三乙氧基硅烷加入5 ~ 20 mL异丙醇中，室温下搅拌24 h，离心洗涤后干燥，得到三氨丙基三乙氧基硅烷修饰的八面氧化亚铜，将0.1g三氨丙基三乙氧基娃烧修饰的八面氧化亚铜和20 mg氧化石墨稀加入到25 ~ 100 mL的水中，随后加入5 mL所制备的立方钯溶液，室温下搅拌3 h，离心洗涤后干燥，得到立方钯-八面氧化亚铜-氧化石墨烯。
[0009]T-2毒素的检测方法
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL的pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
(2)选择计时电流法对T-2毒素抗原进行检测，将输入电压设置为-0.4 V，取样间隔设置为0.1 S，运行时间设置为400 S ；
(3)当背景电流趋于稳定后，每隔50s向磷酸盐缓冲溶液中注入10 yL浓度为5mol/L的双氧水溶液，然后记录电流随时间的变化，绘制工作曲线；
(4)将待测样品溶液代替T-2毒素抗原标准溶液进行检测。
[0010]本发明的有益成果
(I)本发明采用立方钯-八面氧化亚铜-氧化石墨烯具有良好的生物相容性，通过形成钯氮键化学键合至玻碳电极表面。
[0011](2)本发明采用的立方钯-八面氧化亚铜-氧化石墨烯具有大的比表面积，能够有效固定大量的抗体。
[0012](3)本发明采用的立方钯-八面氧化亚铜-氧化石墨烯对双氧水具有优越的电化学催化性能，提高了生物传感器的灵敏度。
[0013](4)本发明采用的立方钯-八面氧化亚铜-氧化石墨烯具有良好的电子的传递效率，进一步提高了生物传感器的灵敏度。
[0014](5)本发明将制备的无标记型生物传感器用于T-2毒素的检测，检测限低，线性范围宽，可以实现简单、快速、灵敏和特异性检测。
【具体实施方式】
[0015]实施例1 一种基于立方钯-八面氧化亚铜-氧化石墨烯构建的T-2毒素传感器的制备方法
(1)依次用1.0,0.3,0.05 Pm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
(2)在电极表面滴加6μ L浓度为I mg/mL的立方钯-八面氧化亚铜-氧化石墨烯水溶液，干燥；
(3)继续将6μ?浓度为5 Pg/mL的T-2毒素抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4°C冰箱中孵化I h，清洗干净；
(4)用3μ L浓度为5 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4°C冰箱中孵化I h，清洗干净；
(5)将6μ L浓度为0.0001 ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的Τ-2毒素抗原用于和抗体的特异性识别，室温下孵化I h，清洗干净，于4°C冰箱中储存备用。
[0016]实施例2 —种基于立方钯-八面氧化亚铜-氧化石墨烯构建的T-2毒素传感器的制备方法
(1)依次用1.0,0.3,0.05 Pm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
(2)在电极表面滴加6μ L浓度为1.5 mg/mL的立方钯-八面氧化亚铜-氧化石墨烯水溶液，干燥；
(3)继续将6μ?浓度为10 Pg/mL的T-2毒素抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4°C冰箱中孵化I h，清洗干净；
(4)用3μ L浓度为10 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4°C冰箱中孵化I h，清洗干净；
(5)将6μ L浓度为0.0001 ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的Τ-2毒素抗原用于和抗体的特异性识别，室温下孵化I h，清洗干净，于4°C冰箱中储存备用。
[0017]实施例3 —种基于立方钯-八面氧化亚铜-氧化石墨烯构建的T-2毒素传感器的制备方法
(1)依次用1.0,0.3,0.05 Pm的氧化铝粉末对玻碳电极进行抛光，分别在超纯水和乙醇中超声清洗，氮气吹干；
(2)在电极表面滴加6μ L浓度为2 mg/mL的立方钯-八面氧化亚铜-氧化石墨烯水溶液，干燥；
(3)继续将6μ?浓度为20 Pg/mL的T-2毒素抗体溶液滴加到修饰电极表面，于4°C冰箱中孵化I h，清洗干净；
(4)用3μ L浓度为20 mg/mL的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4°C冰箱中孵化I h，清洗干净；
(5)将6μ L浓度为0.0001 ~ 10 ng/mL的一系列不同浓度的Τ-2毒素抗原用于和抗体的特异性