Uhplc-ms/ms同时测定防己黄芪汤煎剂中10种化学成分含量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种使用UHPLC-MS/MS技术同时测定防己黄芪汤煎剂中10种化学成 分含量的方法，属于中药成分分析领域。
【背景技术】
[0002] 防己黄芪汤是目前临床常用且疗效显著的中药处方，主要应用于治疗慢性肾炎蛋 白尿、类风湿性关节炎、肩周炎等，该方由粉防己、黄芪、白术及炙甘草组成。虽然防己黄芪 汤在临床应用方面有显著的疗效，但由于其化学成分复杂，以至于目前关于防己黄芪汤化 学成分的研究甚少。防己黄芪汤的主要成分包括生物碱类、黄酮类、内酯类、皂苷类等，传统 的检测技术HPLC-DAD由于检测器的局限性，无法同时对防己黄芪汤中多种类别化学结构 的多个成分同时进行含量测定。
【发明内容】
[0003] 为了解决上述问题，本发明采用UHPLC-MS/MS技术，建立了一种针对防己黄芪汤 中10种不同类别化学结构成分同时进行含量测定的方法，这10种成分在结构上涵盖了生 物碱类、黄酮类、内酯类和皂苷类，这使得所建立的含量测定方法能够深入和全面地控制防 己黄芪汤的质量。
[0004] 发明采用如下技术方案：
[0005] L防己黄芪汤供试品溶液的制备：
[0006] 按照防己黄苗汤的处方比例，分别精密称取粉防己12g，黄苗15g，白术9g，炙甘 草6g，于煎药锅中，先加420mL的水，浸泡lh，武火煮沸后，文火保持微沸状态煎煮30min， 以四层纱布滤出药液，药渣再加336mL水武火煮沸后，文火保持微沸状态煎煮30min，四层 纱布滤出药液，合并两次煎液，加适量水定容到lOOOmL，精密移取药液2mL置50mL量瓶中， 加60%甲醇溶液15mL，超声15min，放冷，用60%甲醇溶液稀释至刻度，12000r/min离心 lOmin，吸取上清液作为供试品溶液；
[0007] 2.混合对照品溶液的配制：分别精密称取粉防己碱，防己诺林碱，白术内酯I， 白术内酯III，毛蕊异黄酮葡萄糖苷，甘草酸，甘草苷，异甘草苷，甘草素，异甘草素对照 品适量，加甲醇溶解稀释，摇匀，得到浓度分别为104. 16,117. 54, 23. 55, 35. 63,635. 92， 2009. 56, 7920. 00,1944. 03,135. 55, 39. Olng · mL 1 的混合对照品溶液；
[0008] 3.测定法：采用UHPLC-MS/MS法分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注 入分析仪器，测定，即得。
[0009] 色谱条件：C18Agilent 色谱柱（2. ImmX IOOmrn, 3. 5 μπι);流速：0· 4mL · min S 柱 温：30°C ;进样量：10 μ L ;梯度洗脱条件：流动相为0. 1%甲酸水溶液与乙腈的混合物，0~ 0. 8min，乙腈的体积分数从5%线性增加至50%，0. 1%甲酸水溶液的体积分数从95%线性 减少至50 %，0. 8~3. Omin，乙腈的体积分数线性增加至90 %，0. 1 %甲酸水溶液的体积分 数线性减少至10%，3. O~3. lmin，乙腈的体积分数线性减少至5%，0.1 %甲酸水溶液的体 积分数线性增加至95%。
[0010] 质谱参数条件：
[0011] 质谱扫描方式为多反应监测模式（MRM)。使用下列参数：离子源温度：500°C ; Ql/Q3(m/z) ：623. 2/381. 3 ；609. 3/367. I ；233. 1/187. 2 ；249. 1/231. 0 ；447. 2/285. I ； 821. 3/351. 2 ;417. 1/255. I ;417. 1/255. I ;256. 2/135. 0 ;256. 2/135. 0 ;去簇电压（DP): 39. 86 ;27. 13 ;63. 96 ;54. 8 ;57 ;-14. 67 ;-17. 32 ;-17. 32 ;-65. 84 ;-65. 84V ;碰撞能量 (CE) :53. 9 ;49· 43 ;22· 61 ;14· 42 ;16· 11 ;-52· 15 ;-23· 39 ;-23· 39 ;-21· 65 ;-21. 65V ;入口 电压（EP) :3. 93 ;4· 29 ;6· 81 ;3· 14 ;6· 38 ;-13· 72 ;-10· 15 ;-10· 15 ;-9· 14 ;-9· 14V ;碰撞 室出 口电压（CXP) :10. 83 ;27· 3 ;14 ;14 ;14 ;-22· 52 ;-21· 88 ;-21· 88 ;-17 ;-17V ;雾化气： 55psi ;辅助加热气：55psi ;气帘气：35psi ;氮气作为喷雾辅助气体。
[0012] 上述步骤3测定法中包括线性关系的测定；精密吸取混合对照品溶液，逐级稀释， 得稀释倍数为1，2,4,8,16, 32,64的系列浓度溶液。
[0013] 上述步骤3测定法中包括精密度的测定；即精密吸取混合对照品溶液：粉防己 碱，防己诺林碱，白术内酯I，白术内酯III，毛蕊异黄酮葡萄糖苷，甘草酸，甘草苷，异甘草 苷，甘草素，异甘草素浓度分别为 52. 08, 58. 77,11. 77,17. 82, 317. 96,1004. 78, 3960. 00， 972. 02,67. 78,19. 51ng · mL 1的混合溶液，在测试条件下连续进样6次，记录各峰面积。
[0014] 上述步骤3测定法中包括重复性的测定；即取同一批防己黄芪汤煎剂，平行制得 防己黄芪汤供试品6份，在质谱条件下分别测定6次，计算每种对照品的色谱峰面积。
[0015] 上述步骤3测定法中包括稳定性的测定；即取防己黄芪汤供试品溶液，室温放置， 于0、2、4、8、12、24h进样，在测试条件下分析，记录各峰面积。
[0016] 上述步骤3测定法中包括回收率试验；精密吸取已知含量的防己黄芪汤煎剂 1.0 mL，平行6份，置于50mL容量瓶中，分别精密加入一定浓度的混合对照品溶液（粉防己 碱，防己诺林碱，白术内酯I，白术内酯III，毛蕊异黄酮葡萄糖苷，甘草酸，甘草苷，异甘草 苷，甘草素，异甘草素的浓度分别为 1306. 00,1389. 50, 290. 00, 538. 50, 3621. 00,41969. 00， 82592. 50,17393. 00,1113. 00, 78. 50) L OmL，加 60 % 甲醇溶液 14mL，超声 15min，放冷，用 60%甲醇溶液稀释至刻度，12000r/min离心10min，吸取上清液，在测试条件下进样分析， 记录各峰面积，并计算方法的加样回收率。
[0017] 本发明的优点是：1.实验结果表明，防己黄芪汤中所测10种化学成分在乙 腈-0. 1 %甲酸水系统梯度洗脱条件下，在短短的3. Imin内即达到有效分离，方法的分析 周期极短、分离效率极高。2.质谱具有高灵敏度和强选择性，能够在准确测定成分含量的 同时，精确给出其质量数信息，达到对化合物进行鉴别的效果。3.本发明对防己黄芪汤中 的10种不同类型化合物进行同时定量分析，操作快捷、重复性好、结果准确可靠，可为防己 黄芪汤煎剂全面质量控制提供依据。
【附图说明】
[0018] 图1是本发明混合对照品溶液中10种成分的提取离子流质量色谱图。图中A-J 分别代表粉防己碱，防己诺林碱，白术内酯I，白术内酯III，毛蕊异黄酮葡萄糖苷，甘草酸， 甘草苷，异甘草苷，甘草素，异甘草素。
[0019] 图2是本发明供试品溶液中10种待测成分的化学结构图。
【具体实施方式】
[0020] 以下通过实施例形式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此 理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均 属于本发明的范围。
[0021] 实施例1 :UHPLC-MS/MS同时测定防己黄芪汤煎剂中10种化学成分含量的方法：
[0022] 1.饮片、仪器与试药
[0023] 1.1饮片来源：黄芪和炙甘草购自南京海昌中药集团（南京，中国）；粉防己和白 术购自河北中药集团（河北，中国）；经南京中医药大学药学院陈建伟教授鉴定，均为正品。
[0024] 1. 2 仪器
[0025] Shimadzu CBM20Alite 高效液相色谱系统（Shimadzu LC20ADXR 栗，SPD20A UV 检 测器，SIL20ACXR自动进样器，CT020AC柱温箱）Jriple Quadrupole 5500质谱仪（美国 AB SCIEX公司），ESI离子源；质谱工作站：Analyst、. 6 ;超声波清洗器（KQ-500,昆山市超 声仪器有限公司）。AG 285电子天平（METTLER T0LED0，d = 0.0 lmg)。纯水仪（南京易普 易达低级发展有限公司，型号：EPED-10TF，编号：0903090818)。高速离心机（长沙湘智离心 机仪器有限公司，型号：XZ-6G)。
[0026] 1. 3 试药
[0027] 粉防己碱（F001130112)(纯度> 98% )、防己诺林碱（F006121121)(纯度> 98% )、毛蕊异黄酮葡萄糖苷（130419)(纯度> 98% )、甘草酸（G003130405)(纯度> 98% )、甘草苷（G009130424)(纯度 > 98% )、异甘草苷（Y120130503)(纯度 > 98% )、甘 草素（G036130119)(纯度> 98% )、异甘草素（Y008130426)(纯度> 98% )购于成都瑞芬 思生物科技有限公司，白术内酯I (ZL120418HB)(纯度> 98% )、白术内酯III (ZL120420HB) (纯度> 98% )购于南京泽朗医药科技有限公司。
[0028] 乙腈为质谱纯（美国Merck公司），超纯水，无水甲酸为质谱纯（Anaqua Chemicals，批号：FA31120500)。
[0029] 2.方法与结果
[0030] 2. 1混合对照品溶液的配制
[0031] 分别精密称取粉防己碱，防己诺林碱，白术内酯I，白术内酯III，毛蕊异黄酮葡 萄糖苷，甘草酸，甘草苷，异甘草苷，甘草素，异甘草素对照品适量，加甲醇溶解并稀释，摇 匀，得到浓度分别为 104. 16,117. 54, 23. 55, 35. 63,635. 92, 2009. 56, 7920. 00,1944. 03， 135. 55, 39. Olng · mL 1的混合对照品溶液；
[0032] 2. 2供试品溶液的配制
[0033] 按照防己黄芪汤的处方比例，分别精密称取粉防己12g，黄芪15g，白术9g，炙甘草 6g，于煎药锅中，先加420mL水，浸泡lh，武火煮沸后，文火保持微沸状态煎煮30min，以四层 纱布滤出药液，药渣再加336mL水武火煮沸后，文火保持微沸状态煎煮30min，四层纱布滤 出药液，合并两次煎液，加适量水定容到lOOOmL，精密移取药液2mL置50mL量瓶中，加60% 甲醇溶液15mL，超声15min，放冷，用60%甲醇溶液稀释至刻度，12000r/min离心10min，吸 取上清液作为供试品溶液；
[0034] 2· 3色谱条件与质谱参数条件
[0035] 色谱条件：C18色谱柱（Agilent, USA, 2. ImmX 100mm, 3· 5 μ m);流速：0· 4mL ?min