适用茶叶中吡虫啉等3种农药多残留速测法及所用试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于小分子化合物的金标免疫分析检测领域，具体设及一种基于直接竞争 免疫层析法的农药残留金标速测试纸条，该试纸条适用于茶叶样品中氯代烟碱类农药化虫 嘟、嚷虫胺和氯嚷嘟的多残留快速检测。
【背景技术】
[0002] 自美国、欧盟、日本加强对进口食品、农产品检疫检验力度后，我国茶叶出口呈现 大幅下降的趋势，其主要原因是农药超标困扰我国茶叶出口。近几年来，由于化虫嘟等氯代 烟碱类农药在茶叶上使用频率高，导致化虫嘟等农药在茶叶上检出率高。2014年8月青岛 出入境检验检疫局对一批进口乌龙茶实施抽样检验时检出化虫嘟超标2倍，进口茶叶也存 在氯代烟碱农药超标问题。欧盟食品安全局巧FSA)发布的报告指出，新烟碱类农药对授粉 昆虫构成"严重风险"，运类农药与蜜蜂死亡有关。鉴于蜜蜂大量死亡，可能影响农作物的授 粉，2013年5月欧盟的15个成员国举行投票，同意实行临时禁令，在未来两年将禁用化虫 嘟、嚷虫胺W及嚷虫嗦3种新烟碱类农药。
[0003] 鉴于常规的农药残留检测仪器分析方法（如气相、液相色谱及质谱联用）满足不 了茶叶样品在较短时间内完成快速检测的需求，因此，人们迫切希望有一种简便、快速、价 廉及信息量大的农残检测技术能在野外现场和实验室内进行大批量的快速筛查试验。迄 今，常见的农药残留现场快速筛查方法为酶抑制显色纸片法，但其检测假阳性比率偏高，受 基质干扰大，检测对象局限于有机憐类和氨基甲酸醋类农药，且特异性不高。近些年来，基 于抗原-抗体特异性反应的免疫化学分析法是农残快速检测技术的研究热点之一，其中研 究报道最多的是酶联免疫吸附法巧LISA)，已研制出多类农药化ISA试剂盒，确实有潜在的 市场应用前景，但检测需要多步反应，仍不能真正实现现场快速筛查。
[0004] 胶体金标记技术是继同位素、酶、巧光素及乳胶标记技术之后的一种新型实用的 标记技术。基于胶体金免疫层析技术的试纸条W其使用便捷、价格低廉、筛查结果可视化、 环境友好性等独特优势更受大众欢迎。近些年来，适用于检测小分子化合物的竞争型金标 试纸条研发也越来越多，有关农药方面的公开报道集中在=嗦类、有机憐类、氨基甲酸醋 类，而针对新烟碱类农药金标试纸条的仅设及化虫嘟、嚷虫嗦和嚷虫胺单残留或双残留的 测定。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、灵敏度高、结果可视化、适用于现 场速测等优点的适用于茶叶中化虫嘟等3种氯代烟碱类农药多残留现场速测试纸条（基于 间接竞争免疫层析法的农药多残留金标速测试纸条）及其具体使用方法。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种适用于茶叶中化虫嘟等3种氯代烟碱类 农药多残留速测的异源竞争免疫层析金标试纸条（基于直接竞争免疫层析法的氯代烟碱 类农药金标速测试纸条），该试纸条包括衬板（例如为PVC衬板）、样品垫（例如为玻璃纤 维样品垫）、金标一抗结合垫、硝酸纤维素膜---NC膜、吸水垫，所述金标一抗结合垫上包被 有胶体金标记的化虫嘟类特异性小鼠单抗（一抗），硝酸纤维素膜一-NC膜上包被有用于 异源竞争的氯嚷嘟或嚷虫胺人工抗原的检测线一-T线和包被有兔抗鼠IgG(二抗）的质控 线C线。
[0007] 备注说明：在本发明中，化虫嘟等3种氯代烟碱类农药就是指化虫嘟、嚷虫胺和氯 嚷嘟。
[0008] 作为本发明的适用于茶叶中化虫嘟等3种氯代烟碱类农药多残留速测的异源竞 争免疫层析金标试纸条的改进：胶体金标记的化虫嘟类特异性小鼠单抗（一抗）是由20~ 40nm(例如为30nm)的纳米金颗粒与化虫嘟类特异性小鼠单抗相结合的复合物，化虫嘟类 特异性小鼠单抗与胶体金的结合浓度为3~lOmg/L(较佳为4mg/L)，即，每1L的胶体金溶 液中配用3~10mg(较佳为4mg)的化虫嘟类特异性小鼠单抗。
[0009] 备注说明：该化虫嘟类特异性小鼠单抗（一抗）对化虫嘟、氯嚷嘟和嚷虫胺的识别 能力接近。胶体金溶液中胶体金的质量浓度为0.01 %;包被量为0.4~0.6iiL/mm2 (较佳 为 0. 5yL/mm2)。
[0010] 作为本发明的适用于茶叶中化虫嘟等3种氯代烟碱类农药多残留速测的异源竞 争免疫层析金标试纸条的进一步改进：检测线一-T线包被的用于异源竞争的氯嚷嘟或 嚷虫胺人工抗原是指将氯嚷嘟半抗原或嚷虫胺半抗原偶联到鸡卵清蛋白（OVA)上的人 工抗原，浓度为100~500mg/L;氯嚷嘟半抗原或嚷虫胺半抗原与OVA的偶联比为8:1~ 15:1(例如为 10:1)。 W11] 兔抗鼠IgG(二抗）的质控线---C线的浓度为50~200mg/L。
[0012] T线和C线的包被量均为0. 04~0. 06yL/mm(较佳为0. 05yL/mm)。
[0013] 作为本发明的适用于茶叶中化虫嘟等3种氯代烟碱类农药多残留速测的异源竞 争免疫层析金标试纸条的进一步改进：所述检测线和质控线所用的稀释液是质量浓度1~ 5%薦糖的0.011?85溶液任^.4憐酸缓冲溶液，口^.4憐酸盐口85缓冲液）。
[0014] 本发明还同时提供了利用上述试纸条进行的茶叶中化虫嘟等3种氯代烟碱类农 药多残留速测法：W茶叶鲜叶、成品茶作为待测样品；
[0015] 直接用开水冲泡待测样品30~60分钟，得茶汤；或者，先将待测样品研磨成粉状 后，加入开水冲泡30~60分钟，得茶汤；
[0016] 取茶汤滴加2~3滴到样品垫的点样区（该点样区位于样品垫的中间位置）中进 行层析反应，5~10分钟后根据检测线和质控线的显色情况直接判断样品中农药的阴阳性 结果；
[0017] 质控线一-C线显红色表示试纸条有效，未显色则试纸条失效；
[0018] 检测线一-T线显红色则判断为阴性，表示茶汤中表示茶汤中未检测到化虫嘟、嚷 虫胺和氯嚷嘟中的任何一种，或茶汤中运3种农药总浓度低于0. 005mg/L;
[0019] 检测线一-T线未显色则判断为阳性，表示茶汤中化虫嘟、嚷虫胺和氯嚷嘟总浓度 高于（> )0. 005mg/L。
[0020] 备注说明：粉红色即显色不完全，表示偏阳性，且"检测线一-T线未显色"比"T线 显示浅红色"代表茶汤中化虫嘟、嚷虫胺和氯嚷嘟残留的浓度高。
[0021] 作为本发明的茶叶中化虫嘟等3种氯代烟碱类农药多残留速测法的改进：
[0022] 所述成品茶包括：绿茶、红茶、乌龙茶、白茶、黄茶、黑茶。
[0023] 在本发明中，采用质量浓度1-5%薦糖的0.011?85溶液任^.4憐酸盐口85缓冲 液）作为稀释液可W保护包被抗原和包被二抗，从而延长抗原和二抗的活性。
[0024] 本发明采用的是一种间接封闭模式，即样品垫中完全吸附封闭液并作干燥处理， 在样品检测过程中待测样品带动样品垫上的封闭液到NC膜上，从而达到间接封闭的效果。 异源竞争的氯嚷嘟或嚷虫胺抗原是指将氯嚷嘟或嚷虫胺半抗原偶联到鸡卵清蛋白（OVA) 上的复合物。本发明的速测试纸条可检测茶叶中的3种氯代烟碱类农药，分别是化虫嘟、嚷 虫胺和氯嚷嘟。所述的茶叶种类包括中国六大茶类：绿茶、红茶、乌龙茶、白茶、黄茶、黑茶。 [00巧]本发明的有益效果：本试纸条采用胶体金标记化虫嘟一抗（胶体金标记的化虫嘟 类特异性小鼠单抗）作为免疫金标探针，可W同时监测茶叶中化虫嘟、嚷虫胺和氯嚷嘟运3 种氯代烟碱类农药的残留，是一种快速简便的多残留筛查手段。本发明根据之前已公开报 道的化虫嘟抗原制备得到了化虫嘟类特异性单抗，能同时识别化虫嘟、嚷虫胺和氯嚷嘟运3 种氯代烟碱类农药，同时选用氯嚷嘟或嚷虫胺人工抗原来建立异源竞争免疫层析技术，运 有利于提高竞争式免疫层析法的灵敏度。所制备的多残留检测试纸条对茶汤样品中3种氯 代烟碱类农药的肉眼判断灵敏度均可达到〇.〇〇5mg/L。本发明的试纸条具有灵敏度高、特异 性好、使用便捷、结果可视化等优点，将来有望在其他农产品上得到应用拓展。
[00%] 化虫嘟、嚷虫胺和氯嚷嘟3种农药同时检测的金标试纸条还未见公开报道，本发 明首次制备了该测试纸条。
[0027] 与现有的速测试纸条方法原理相比，本发明利用了化虫嘟类特异性抗体与抗原的 异源反应原理，实现了化虫嘟、嚷虫胺和氯嚷嘟3种农药的多残留检测，具有检测谱宽、灵 敏度高、特异性好、使用便捷、结果准确等优点。本发明具备良好的实用性，试纸条可应用于 现场筛查茶叶鲜叶和成品茶样品中3种氯代烟碱类农药残留量及超标检测与诊断，检出限 均为0. 005mg/l，符合我国现行食品安全标准要求，检测时间5~10分钟。该产品技术具有 灵敏度高、使用便捷、结果准确、成本低的优点，对于加强茶叶生产的质量安全监督管理具 有良好的应用前景。
[0028] 综上所述，本发明采用化虫嘟类特异性单抗和氯嚷嘟或嚷虫胺抗原建立了异源竞 争免疫层析技术，所制备的金标试纸条能同时检测化虫嘟、氯嚷嘟和嚷虫胺3种氯代烟碱 类农药，且重点应用于茶叶样品中上述3种农残的速测。同时本产品能够实现茶叶现场采 摘时对化虫嘟、嚷虫胺和氯嚷嘟进行快速筛查，若发现茶叶中该类农药超标可通过延缓采 摘时间等方式来降低茶叶中的农药残留。目P，通过此判定方法直接判断样品中化虫嘟、嚷虫 胺和氯嚷嘟的阴阳性结果，检测灵敏度高、使用快捷、结果直观。
【附图说明】
[0029] 下面结合附图