糖尿病肾病早期检测标记组合物，试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001]本申请涉及一种早期检测糖尿病肾病的标记组合物，相应的检测试剂盒/以及该组合物和试剂盒的使用方法。
【背景技术】
[0002]随着环境因素的改变，糖尿病发病率快速攀升，已蔓延成为全球性问题。据估测，2030年全世界糖尿病患者数量将从2000年的1.71亿增加到3.66亿。我国糖尿病人口也正在急剧增加，已成为一个重要的公共健康问题。从2007年6月至2008年5月我国调查了包括14省市的目标人群，结果显示年龄标化的总糖尿病患病率(包括既往诊断的糖尿病和既往未诊断的糖尿病)为9.7%，据此推算，中国当时已有9240万成年人(年龄220岁)患有糖尿病。我国2010年卫生经济学调查分析报告，糖尿病医疗费1734亿人民币/年，是非糖尿病人的3-4倍，约占家庭收入的22%，其中出现慢性并发症的患者所用医疗费更多。糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是伴随长期糖尿病而发展的肾病，其可造成异常液体的滤过及尿中白蛋白分泌增加，最终导致肾衰竭，其严重影响患者生活质量和威胁患者生命，是糖尿病病人最重要的合并症之一。国内最新研究表明I型糖尿病患者糖尿病肾病患病率为35%，2型糖尿病患者约有15%并发DN。针对2型糖尿病患者微量白蛋白尿的患病率和危险因素进行的全球流行病学研究(DEMAND研究结果更加另人震惊:2型糖尿病患者蛋白尿患病率约50 %，其中微量白蛋白尿患病率为39 %，亚洲地区微量白蛋白尿患病率更是高达43%。这些数据表明，2型糖尿病合并肾损害是一个相当普遍的现象。随着科技进步，DN的治疗水平已较以往有很大提高，但其仍然是终末期肾病最主要的原因，约占全部终末期肾病病例的44%，研究显示，DN的预后不良多与不能及时诊断造成的治疗延误有关。DN被认为是上述综合因素共同参与、相互作用的结果，但确切的分子机制仍不完全清楚。因此，现代医学缺少有效的治疗措施，患者一旦确诊，病情会逐步进展。其次，DN的早期诊断仍存在问题。糖尿病肾病的诊断包括肾脏病理诊断与临床诊断。糖尿病肾病的主要病理变化是肾小球结构及形态的改变。这种特征性的病理表现只在人类的DN才出现，在各种DN的动物模型中没有发现这种改变。肾活检对肾脏疾病的诊断价值已得到公认，是肾脏病诊断的金标准，但其存在创伤大，患者不易接受的特点，并且由于对活检操作者的技术要求，以及患者当地医疗水平的限制，该项检测方法具有很大的局限性，严重影响了糖尿病肾病患者的早期诊断和及时治疗。研究DN的早期诊断方法，寻求延缓DN进程的有效治疗方法的评价，具有重要的理论和实践意义。
[0003]尿液的检查因其无痛，无创伤性而有利于临床检验和科学研究。正常尿液中可含有少量的蛋白成分，如白蛋白、糖蛋白和微球蛋白等。尿液中的蛋白质构成及其丰度取决于肾小球滤过功能，近端肾小管对蛋白质的重吸收功能和刷状缘溶酶体酶的活性。血液中出现的异常蛋白或肾脏本身疾病而产生的蛋白都可能以原形或降解的肽段的形式出现在尿液中，使尿液呈现特异的蛋白质谱。这种蛋白谱的出现一可以反应疾病的病理生理过程；同时，由于尿液蛋白谱的改变可能早于临床症状的出现，使之有可能成为预测或早期诊断疾病的手段。但目前仅常规测量几种尿液参数，例如，肌酸酐，尿素，白蛋白，血细胞(红细胞、白细胞以及细胞管型等)，细菌，糖，尿胆素原，胆红素和PH值。这些分析对于诊断DN是十分有限的，而且上述指标在其他疾病状态时也会有所改变，缺乏足够的灵敏度和选择性，特别是在DN早期，一些指标的变化并不明显，因此，迫切需要我们寻找更加灵敏、特异、有效的检测指标用于DN的早期诊断中。
[0004]现有技术中对于尿液蛋白的检测多采用二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALD1-T0F)以及液相层析串联质谱等技术实现，但上述技术操作比较复杂，不适于广泛临床应用和推广，更不适于早期疾病筛查。
[0005]LUMINEX技术是一种多功能的液相芯片分析平台，其整合了有色微球、激光技术、应用流体学、高速数字信号处理和计算机运算法则，具有极高的检测特异性和灵敏度。传统的蛋白质分析主要采用双抗体夹心ELISA法。此法长期以来被视为蛋白质定量分析的“标准方法”。ELISA可以用来准确测定大批量生物样品，但每次实验只能分析一个目标分子，而不具备同时分析多种目标分子的能力。在ELISA基础上发展出的LUMINEX技术，不仅同样通过双抗体选择而具有高特异性，同时也具有ELISA的高通量、操作简便、测量准确等优点，而且可以在一次实验中完成对多种目标分子的分析，从而改变了过去的分析模式，建立了更加高效快速的分析平台。LUMINEX技术应用微球和流式细胞仪的原理，其中微球技术是LUMINEX的特色所在。LUMINEX公司在其早期的研究基础上发现，最初采用根据微球大小来区分出的微球类型数目受到很大限制，因此，LUMINEX系统采用2种不同荧光染料对同一大小的微球进行染色，每种染料分别有10种不同的浓度梯度，而这2个浓度梯度进行自由组合后就可以得到100种可区分的不同颜色的微球，这样不同的荧光微球上包被不同的检测分子，就可以在一个反应体系里同时检测100种不同的分子。LUMINEX的检测系统通过2束不同波长的激光进行检测，635nm的红色激光照射微球后，微球能发射658nm和712nm的荧光，根据探测到的荧光微球的荧光强度来判断是哪种微球，从而对探针分子定性；另一束532nm的绿色激光用来激发探针分子上的P E染料，通过对P E发出的橙色荧光强度的测量，来对待检生物分子进行定量。通过这个反应体系，我们就能够快速的对同一个样本中的不同指标参数进行定性定量检测，由于其处理样本类似计算机芯片密度高、速度快，且在溶液中进行，故称之为液相芯片技术。LUMINEX应用的荧光编码微球带有针对不同目标分子的特异性抗体不同的微球在一定程度上可以自由组合，这样在一次实验中可以同时完成多个目标分子的分析。多目标分子的同时测定可以大大减少生物样品的消耗量，节省成本和测定时间，并且使多种目标分子之间相关性的分析更加准确。LUMINEX技术通过鉴定微球的颜色来确定反应类型，而对反应的定量分析是通过靶物质上的报告分子完成的，具有多参数高通量分析，操作简单，灵敏度高的特点。
[0006]基于现有技术中的不足，本申请采用LUMINEX技术筛选获得糖尿病肾病早期患者尿液中相关的蛋白标记物分子，并将其置备成试剂盒进行糖尿病肾病早期诊断。
【发明内容】
[0007]本发明目的在于提供一种糖尿病肾病早期检测蛋白标记物组合物，所述蛋白标记物组合物选自尿转铁蛋白、铜蓝蛋白、β 2-微球蛋白(β 2-MG)、α 1-微球蛋白(α 1-MG)、微量白蛋白(MAlb)、Galectin-1、泛素核糖体融合蛋白52 (UbA52)、弹性蛋白酶ΙΙΙΒ、α 1-酸性糖蛋白、尿调制蛋白(Uromodulin)、C0L4A6、C0L2A1、Fractalkine、CINC_3、Podocalyxin、Smad7、中性粒细胞趋化因子-3 (CINC-3)、IFN- γ、IL-1 α、IL-10、IL-10、TNF- α、脂多糖诱导的CXC趋化因子(LIX)中的至少3种，优选至少5种。
[0008]进一步地，所述蛋白标记物组合物为β2_微球蛋白(02-MG)、α 1-微球蛋白(a 1-MG)、微量白蛋白(MAlb)、Galectin-1、泛素核糖体融合蛋白52 (UbA52)、弹性蛋白酶IIIBn α 1-酸性糖蛋白、尿调制蛋白(Uromodulin)、C0L4A6、C0L2A1、Fractalkine。
[0009]本发明还提供一种筛选糖尿病肾病早期检测蛋白标记物组合物的方法，其具体步骤包括:(1)采集2型糖尿病患者伴有糖尿病肾病、2型糖尿病患者无糖尿病肾病以及正常人尿液样本，并根据尿蛋白排泄率UAER和肾小球滤过率GFR进行分析和分组；(2)应用LUMINEX系统对各组尿液中蛋白标记物分子的表达水平进行检测；(3)统计学方法ANOVA筛选出可用于糖尿病肾病早期诊断的蛋白标记物，联合应用所述标记物建立以多因子分析为特征的糖尿病肾病早期诊断和预警体系。
[0010]本发明提供一种糖尿病肾病早期检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括特异性结合糖尿病肾病尿液中蛋白标记物的抗体和使用所述试剂盒进行糖尿病肾病早期检测的使用说明，所述糖尿病肾病尿液蛋白标记物为β 2-微球蛋白(β 2-MG)、α 1-微球蛋白(a 1-MG)、微量白蛋白(MAlb)、Galectin-1、泛素核糖体融合蛋白52 (UbA52)、弹性蛋白酶IIIBn α 1-酸性糖蛋白、尿调制蛋白(Uromodulin)、C0L4A6、C0L2A1 和 Fractalkine。
[0011]本发明所述的糖尿病肾病早期检测试剂盒还包括如下组分:(1)96孔滤膜板和两张封板膜；(2)糖尿病肾病早期检测蛋白标记物的标准品；(3)指控对照；(4)鞘液；(5)洗液；(6)焚光羧基微球；(7)羧基微球偶联试剂；(8) streptavidin-phycoerythrin标记抗体；(9)糖尿病肾病早期检测蛋白标记物抗体。
[0012]需要说明的是，本发明所述的糖尿病肾病早期检测试剂盒检测针对的检测样本是尿液。
【具体实施方式】
[0013]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释发明，并不用于限定本发明。
[0014]除非上下文清楚地要求，否则，贯穿本说明书和权利要求，用于“包括”、“包含”等应以包含性的意义来解释而不是排他性或穷尽性的意义，即，其含义为“包括