Gpi胶乳增强免疫比浊法体外定量测定诊断试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用胶乳增强免疫比浊方法测定人体体液（包括血清和关节腔 积液）中GPI (葡萄糖6磷酸异构酶，Glucose-6-phosphateisomerase)含量的试剂盒，属 于医学免疫体外诊断领域。
【背景技术】
[0002] 葡萄糖 _6_ 磷酸异构酶（glucose-6-phosphateisomerase，GPI或G6PI)是糖酵 解和糖异生过程中的一种重要酶类，GPI缺乏会引起人非球形红细胞性溶血性贫血，在类 风湿性关节炎（RA)患者的血清和关节液中其浓度明显增高，在多种癌症比如胃肠癌，胸腺 癌，肾脏癌症中也被发现其浓度明显增高。
[0003]GPI广泛存在于各种细胞胞质内，目前研究发现，GPI存在24个同种异构体，其结 构特点极其相似。GPI存在于各种细胞胞质内，是糖酵解和糖异生的重要酶类，并可作为一 种细胞因子或生长因子分泌于细胞外，刺激细胞运动，与肿瘤的代谢与发展密切相关。其基 因位于第十九号染色体，基因跨度大于40kbp，包括18个内含子。17个外显子，蛋白全长约 56ku，是一种多功能分子，于真核生物、细菌和原核生物以及人体各组织细胞中广泛存在。 它的主要功能是催化6-磷酸葡萄糖和6-磷酸果糖之间的转化，并可诱导髓样干细胞向单 核细胞以及B细胞向成熟抗体分泌细胞的分化。GPI缺乏会引起人非球形红细胞性溶血性 贫血，同时会出现神经损害症状。这是一种常染色体隐性遗传性疾病，而实验发现该病由于 插入了脯氨酸，H20 -P和L339 -P变异影响酶的折叠和活化从而引起相应临床症状。
[0004]GPI是体内的一种自身抗原，有研究表明，GPI在RA患者尤其在活动期血清和关节 液中明显增高，并出现GPI水平与RA疼痛和肿胀关节数呈正相关。RA是以关节慢性炎症损 伤为主的自身免疫性疾病，发病两年内即可出现不可逆的骨关节破坏，其确切病因和发病 机制至今尚不完全清楚。因而RA的早期诊断，治疗对控制该病的病情非常重要。而RA作 为一种免疫功能紊乱所引起的自身免疫性疾病，患者体内有多种自身抗原和自身抗体，不 同患者的自身抗原可能不同。有文献报道，GPI抗原存在于大多RA患者血清和关节液中，血 清中GPI抗原以0. 33ug/ml或0. 2ug/ml作为阳性分界点，可检测出大部分的RA患者。有 研究显示，GPI与RA患者的病程、功能分级、肿胀关节数、压痛关节数、握力及晨僵持续时间 存在相关性，而与年龄无关，提示GPI对于RA患者的病情发展程度以及预后判断也有一定 的指导意义。
[0005] 在RA患者中，GPI作为自身抗原可诱导机体其它免疫细胞产生细胞因子引起关节 炎，GPI同时也与抗GPI自身抗体结合，形成免疫复合物引起关节炎症状的进一步加重。近 年来有文献报道在RA患者的血清和关节液中检测到了高水平的GPI抗体和可溶性GPI分 子。此外，Kassahn等在RA患者的血清和关节液中发现高水平的GPI及其免疫复合物，通 过激光共聚焦显微镜和免疫组化发现RA患者的关节滑膜或滑膜的小动脉及毛细血管有高 密度的GPI表达，认为可能与血管内皮生长因子（VEGF)有关。因此，一些文献认为GPI可 能是通过内皮细胞或滑膜液中的可溶性蛋白递呈给免疫系统，同时GPI免疫复合物还可通 过FC受体介导替代途径激活补体诱发或加重关节炎症。另外，有学者还发现IgG的沉淀 干扰了软骨表面的保护因子通路，GPI-抗GPI抗体复合物覆盖在软骨表面，引起硅酸盐类 物质的破坏，从而引起关节破坏。而Yu等在肿瘤细胞内发现GPI可以调苄基质金属酶蛋白 23(matrixmetalloproteinase23,MMP23)，MMP23在RA患者的滑膜细胞和血管内皮细胞、 成纤维细胞中高表达，有明显促进骨破坏的作用，甚至有促进淋巴细胞增生的作用。由此说 明GPI抗原与RA滑膜增生、血管翳形成、骨与软骨的破坏密切相关。总之，GPI与RA发病 有高度的相关性，高水平的GPI通过多种可能机制诱发RA的发生。
[0006] 目前常用的葡萄糖-6-磷酸异构酶的检测是采用双抗体夹心法（ELISA)原理对人 血清或人关节腔积液中GPI进行检测。ELISA法试剂盒用纯化的抗体包被微孔板制成固相 抗体，向包被单抗的微孔中依次加入GPI、生物素化的抗人GPI抗体、HRP标记的亲和素，经 过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转 化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的GPI呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸 光度值（0D值），计算样品浓度，其浓度在0. 16ug/ml以下为正常，在0. 16-0. 33ug/ml为可 疑，大于〇.33ug/ml时为阳性。ELISA法虽然对设备要求较低，但是步骤繁琐，耗时耗力，不 利于大规模检测。
【发明内容】
[0007] 本发明提供一种利用胶乳增强免疫比浊方法测定人体体液（包括血清和关节腔 积液）中GPI含量的试剂盒，所述试剂盒包括：（I)GPIRl试剂；（2)GPIR2试剂；（3)GPI校 准品。
[0008] 为实现上述目的，本发明的技术方案包括：
[0009] (I)GPIRl试剂，是一种为试剂盒提供适当反应环境、使抗原保持天然构象并控制 反应达到终点的时间和速率的试剂，包含电解质、促凝剂、稳定剂、表面活性剂、防腐剂及缓 冲液。
[0010] (2)GPIR2试剂，是一种含有抗人GPI多克隆抗体包被胶乳颗粒的均一的乳白色 液体，包含抗人GPI多克隆抗体包被胶乳颗粒、电解质、稳定剂、表面活性剂、防腐剂及缓冲 液。
[0011] (3)GPI校准品，用来与样本比较进行结果计算，包含防腐剂、电解质、稳定剂、GPI 抗原及缓冲液。
[0012] 在本发明的一实施方案中，胶乳比浊法测定人体体液（包括血清和关节腔积液） 中GPI含量的试剂盒包括：GPIRl试剂、GPIR2试剂和GPI校准品，其中：
[0013] 所述GPIRl试剂的主要成分为：0. 1 %-5.0%电解质、2%-6%促凝剂、0. 1 %-1 % 稳定剂、〇. 1% -1. 〇%表面活性剂、〇. 05% -0. 1%防腐剂及pH7-9、浓度范围为IO-IOOmmol/ L的缓冲液；
[0014] 所述GPIR2试剂的主要成分为抗人GPI多克隆抗体包被胶乳颗粒和占其质量百 分比为：〇. 1% -5. 0%电解质、0. 5% -5%稳定剂、0. 1% -1. 0%表面活性剂、0. 05% -0. 1% 防腐剂及PH7-9、浓度范围为10-100mm〇l/L的缓冲液；
[0015] 所述GPI校准品的主要成分为：0.1% -5.0%电解质、0.5% -5%稳定剂、 0. 05% -0. 1%防腐剂、0-330ng/mlGPI抗原及溶解在预处理的人血清基质中、pH6. 5-8. 0、 浓度为10-100mm〇l/L的缓冲液。
[0016] 本发明所用的多克隆抗体。可选自绵羊或兔子等健康的免疫动物，此类抗体效价 高成本低，具有一定优势。本发明所用的胶乳颗粒，直径范围为60-300nm，浓度为0.l-5mg/ ml。本发明所述胶乳颗粒为聚苯乙烯胶乳，其表面修饰有功能团，功能团可以是羧基、氨基、 羟基、酰肼或氯甲基的一种。在本发明的一实施方案中，所用胶乳颗粒优选表面修饰羧基， 直径在80_140nm，优选120nm。
[0017] 本发明所用的包被抗体到胶乳颗粒表面的方法为化学交联法，该方法是通过化 学交联剂在交联缓冲液中进行的，所用的化学交联剂选自碳化亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、 N-羟基硫代琥珀酰亚胺、酰肼、异氰酸酯或其组合：交联缓冲液选自不含氨基的缓冲液， MES、M0PS0、MOPS、HEPES、磷酸盐缓冲液，pH在 6. 0-8. 0 之间。
[0018] 本发明所述电解质选自无机盐类，氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁或其组合，优选 氯化钠，浓度在〇. 1% -5.0%之间。
[0019] 本发明所述稳定剂选自牛血清白蛋白、酪蛋白、鱼皮明胶蛋白、葡萄糖、果糖、甘露 醇、壳聚糖、山梨醇、乙二胺四乙酸二钠或其组合。
[0020] 本发明所述促凝剂选自PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、硫酸葡聚糖钠，优选 PEG-6000〇
[0021] 本发明所用表面活性剂选自吐温系列、脂肪醇聚乙二醇醚类、聚氧乙烯苯基醚、聚 氧乙烯月桂醚系列或其组合，优选吐温20。
[0022] 本发明所述防腐剂选自叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸乙酯、ProClin 系列、三嗪类有机化合物等，优选叠氮钠。
[0023] 本发明所述GPI校准品，包含含量在0-330ng/mlGPI抗原，其中所述GPI校准品 1为不含GPI抗原的预处理人血清；GPI校准品2、3、4、5、6为添加不同GPI抗原含量的预处 理血清。
[0024]本发明所述GPI校准品中的GPI选自从人体体液中提取、纯化而得的天然GPI，纯 度彡95%。
[0025] 本发明试剂盒，采用胶乳增强免疫比浊法定量检测GPI，其原理是：利用化学交联 法将特异的羊抗人GPI多克隆抗体包被到胶乳颗粒表面，当被测样本中有GPI抗原时发生 抗原抗体免疫反应，形成抗原-抗体-胶乳颗粒复合物，形成的复合物可与邻近的胶乳颗粒 连接，最终交织成网状引起反应体系池度的显著变化，保持反应体系中抗体过量时，此时反 应后体系浊度的变化与GPI的量成正比，根据GPI校准曲线即可进行定量分析。
[0026] 在本发明中，人体体液中的GPI与胶乳颗粒包被的羊抗人GPI多克隆抗体发生抗 原抗体反应，形成抗原-抗体-胶乳颗粒的复合物，导致浊度上升，测定此浊度在570nm波 长处得吸光度，对照校准曲线即可求出样本中GPI的含量。
[0027] 相较于现有的ELISA法试剂盒，本发明用化学交联法将特异性的羊抗人GPI抗体 包被到羧基修饰过的胶乳颗粒表面，并通过添加稳定剂和表面活性剂使胶乳颗粒形成均一 稳定的悬浮液，实现均相免疫反应体系，使用简便快速，适应临床快速高通量筛查的要求。