用于测定铝盐制备物的内毒素含量的方法

用于测定铝盐制备物的内毒素含量的方法
【专利说明】用于测定铝盐制备物的内毒素含量的方法发明领域
[0001]本发明提供测定用于药物中、具体而言用作疫苗中的佐剂的铝盐制备物中的内毒素含量的方法。
[0002]发明背景
肠胃外药物需要致热原或内毒素(LAL)测试。经典的内毒素测定不能用于测试铝盐的内毒素含量。添加至产品中的内毒素对照由于其与铝盐的相互作用的特性而没有回收。测定有效性标准需要回收且能够测量大量招浓缩物(bulk aluminium concentrat1ns)中的对照内毒素。鉴于该相互作用，通常认为标准内毒素测试不适合于铝盐佐剂中的内毒素测试。唯一适合于测定内毒素的测试是涉及将铝盐注射入兔的兔致热原测试。需要改进的方法。
[0003]发明概述
本发明提供准确地定量铝盐制备物中的内毒素的方法。本发明提供用于测定用于药物中(具体而言用作疫苗中的佐剂)的铝盐制备物中的内毒素含量的方法，其包括以下步骤:
a)混合铝盐与解吸缓冲液，由此从铝盐解吸任何内毒素；
b)将所述铝盐与所述内毒素分离；和
c)测量内毒素的量。
[0004]本发明进一步提供制备用于测定用于药物中(具体而言用作疫苗中的佐剂)的铝盐制备物中的内毒素含量的方法的解吸缓冲液的方法，其包括以下步骤:
a)混合如本文所定义的碱、如本文所定义的金属螯合剂和水；任选地
b)搅拌混合物(具体而言持续等于或大于30秒，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15分钟)；和任选地
c)将混合物孵育等于或大于5、10、15、20、25或30分钟。
[0005]详述
本发明提供用于测定用于药物中(具体而言用作疫苗中的佐剂)的铝盐制备物中的内毒素含量的方法，其包括以下步骤:
a)混合铝盐与解吸缓冲液，由此从铝盐解吸任何内毒素；
b)将所述铝盐与所述内毒素分离；和
c)测量内毒素的量。
[0006]本发明提供用于测定用于药物中(具体而言用作疫苗中的佐剂)的铝盐制备物中的内毒素含量的方法，其包括以下步骤:
a)混合铝盐与解吸缓冲液，由此从铝盐解吸任何内毒素；
b)离心混合物，由此将所述铝盐与所述内毒素分离；和
c)测量上清液的内毒素含量。
[0007]本发明进一步提供用于测定用于药物中(具体而言用作疫苗中的佐剂)的铝盐制备物中的内毒素含量的方法，其包括以下步骤: a)混合铝盐与解吸缓冲液，由此从铝盐解吸任何内毒素；
b)离心混合物，由此将所述铝盐与所述内毒素分离；
c)将上清液转移至无致热原容器；和
d)测量所述上清液的内毒素含量。
[0008]术语“内毒素”在本文中用于指在欧洲药典5.1.10中定义的，即内毒素被视为源自革兰氏阴性细菌的脂多糖类(LPS)和/或脂寡糖类(L0S)。
[0009]混合步骤之后和分离/离心步骤之前，可以孵育铝盐制备物和解吸缓冲液，以确保解吸结合至铝盐的任何内毒素。因此，提供本发明的方法，其中将混合物铝盐和解吸缓冲液孵育大于 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23 或 24 小时。在具体实施方案中，孵育期为小于96或72小时，即孵育期为1小时至96小时、5小时至72小时、10小时至48小时、15小时至36小时或20小时至28小时。在一个具体实施方案中，混合物在孵育步骤过程中没有搅拌。
[0010]以1:9至9:1，例如2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:2或8:2的比率合适地混合铝盐制备物和解吸缓冲液。在具体实施方案中，以3:7、4:6、5:5、6:4 7:3之间，具体而言4:6、5:5和6:4的比率混合铝盐制备物和解吸缓冲液。
[0011]本发明的方法可以在允许从铝盐解吸内毒素的任何温度进行。合适地，提供本发明的方法，其中所述孵育在10 °C至70 °C，例如20 °C至65 °C、20 °C至60 °C、15 °C至30 °C、17 °C至28°C、19°C至26°C、21°C至23°C或在约室温(约22°C )进行。
[0012]本发明的方法可以包括搅拌铝盐和解吸缓冲液的混合物以确保解吸缓冲液与铝组合物混合的步骤。合适地，提供本发明的方法，其中铝盐和解吸缓冲液的混合物在步骤a)之后搅拌多于30秒、40秒、50秒、1分钟、1分钟30秒或2分钟。
[0013]本发明的方法中可以使用促进内毒素解吸的任何缓冲液。适用于本方法中使用的解吸缓冲液可以通过以下确定:将候选缓冲液暴露于包含已知量的内毒素(例如20 EU/ml)的铝盐，在室温孵育约24小时+/-4小时，以10，000 rpm +/- 1000 rpm离心10分钟+/-1分钟，且然后对上清液进行LAL测试。解吸50至200%的内毒素的缓冲液被认为是合适的解吸缓冲液。
[0014]提供本发明的方法，其中所述解吸缓冲液包含盐和金属螯合剂。合适的盐是技术人员众所周知的，且包括但不限于Na2HP04。Na2HP04通常以15%至25%，例如约18 %，例如17.8%的量(EDTA 0.224%, pH8.0)使用。
[0015]在一些实施方案中，具体而言其中本发明的方法用于测定氢氧化铝的内毒素含量，解吸缓冲液可以包含其他盐，例如NaCl。当使用NaCl时，通常解吸缓冲液包含5至250mMNaCL.
[0016]合适的金属螯合剂是技术人员众所周知的，且包括但不限于EDTA(乙二胺四乙酸)。EDTA通常以0.2%至0.3%，例如约0.22%，例如0.224%的量使用。
[0017]解吸缓冲液可以是促进从铝盐解吸内毒素的任何pH。在一个实施方案中，本发明的解吸缓冲液具有大于pH5.5的pH，具体而言当解吸缓冲液用于从磷酸铝解吸内毒素时。提供本发明的方法，其中所述解吸缓冲液为约PH7至pH9。在一个具体实施方案中，提供在约pH 8 (例如pH7.5至8.5)的解吸缓冲液。
[0018]在一个实施方案中，本发明的解吸缓冲液具有大于pH9.5的pH，具体而言当解吸缓冲液用于从氢氧化铝解吸内毒素时。提供本发明的方法，其中所述解吸缓冲液为约PH9.5至ρΗΙΟ.5。在一个具体实施方案中，提供在约pH1的解吸缓冲液。在一个具体实施方案中，pH为小于pH 10.5。
[0019]解吸缓冲液可以是在防止缓冲液的一种或多种组分的沉淀的任何温度，具体而言当以浓缩的例如1.5至2倍浓缩物储存时。合适地，提供本发明的方法，其中所述解吸缓冲液储存于约30°C至45°C、35°C至40°C、36°C至38°C或约37 °C的温度。
[0020]所述解吸缓冲液理想地无内毒素，合适地，提供本发明的方法，其中所述解吸缓冲液基本上无内毒素，S卩使用技术人员已知的任何技术无法检测到内毒素。
[0021]内毒素从铝盐解吸且合适地分离，以允许测试内毒素含量。分离可以使用技术人员已知的任何方法来进行。合适地，提供本发明的方法，其中以沉淀铝盐且使内毒素维持于上清液中所需的力离心混合物。具体而言，提供本发明的方法，其中以1000至1500 X g,例如约1118 X g离心解吸缓冲液和铝盐的混合物。
[0022]解吸的内毒素含量可以根据技术人员可用于测量内毒素的任何测试来测量。具体而言，提供本发明的方法，其中测量内毒素含量。具体而言，提供本发明的方法，其中定量内毒素含量。技术人员可用且已知的方法包括但不限于鲎变形细胞溶解物(LAL)测定、单核细胞活化测试或EndoLISA方法。具体而言，内毒素在本发明的方法中通过LAL(具体而言通过动态显色法)进行定量。
[0023]本发明的方法可以用于测定用作疫苗中的佐剂的任何铝盐的内毒素含量。合适的铝盐佐剂是技术人员众所周