测定影响根际土壤氨基酸有效性因素的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于土壤生态学领域，具体是测定影响根际土壤氨基酸有效性因素的方法。
【背景技术】
[0002]土壤中包含多种含氮的化合物，如无机氮、氨基酸、多肽及蛋白质，除无机氮外，氨基酸也可以作为植物生长的重要氮源。Chapin等(1993)首次发现无菌根的维管植物喜欢吸收氨基酸，北极苔原无菌根植物白羊毛胡子草吸收氨基酸的量至少占总吸收氮量的60%，且在以氨基酸为唯一氮源培养时吸收的氮及形成的生物量均比以无机氮为氮源时要多。诸多研究者通过根系短期吸收试验、实验室有机氮源无菌培养试验、野外植物对同位素标记有机物质(13C，15N双标记)的吸收及植物组织的15N自然丰度等方法，表明许多植物可以吸收利用环境介质中的多种氨基酸、简单蛋白质等有机氮化合物，而无需将有机氮转化为无机氮才能被植物吸收利用。
[0003]然而，土壤中一系列因素会影响氨基酸的生物有效性，例如土壤pH、氧化还原电位、氮素组成及生物有效性、土壤矿物组成等等。这些因素错综复杂，研究单一因素对氨基酸营养贡献的影响难以准确评价土壤中的交互作用，多因素多水平的试验工作量较大且难以实现。采用多种土壤综合分析是解决这个问题的有效方法。我国幅员辽阔，植被类型及土壤类型众多，因降雨量及温度的巨大差异，从南到北土壤类型呈现明显的地带性。自南向北，分布着砖红壤、赤红壤、红壤、黄褐土、黄棕壤、棕壤、暗棕壤、黑土、漂灰土等一系列质地差异较大、理化性质明显不同的土壤。以这些土壤为基础，研究氨基酸的生物有效性，就可以综合分析影响氨基酸的生物有效性的土壤因素。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种测定影响根际土壤氨基酸有效性因素的方法，通过以下步骤实现:
(1)土壤样品采集:采集具有代表性的地带性土壤15个，采集点位于典型的土壤类型带，砖红壤位于广西、广东、海南，赤红壤位于湖南、广西、广东，红壤位于江西、湖北、湖南，黄褐土、黄棕壤位于江苏、安徽，棕壤位于河北、河南，暗棕壤、黑土、漂黑土位于东北三省，取样时先用?产子去除表土的枯枝落叶层，取0-15cm的表层土壤5kg，同时准确记录取样点位置及种植制度和植被类型；
(2)样品前处理:样品挑出石块及根系后，过4mm筛后放置于通风干燥处风干，之后研磨过2mm筛，装袋备用；
(3)植物种植:称取47g风干土壤样品，放置于50ml离心管中，轻微震荡离心管，避免出现空隙，该离心管直径为25mm，高度为120mm，取预先放置于培养皿中发芽的植物种子，放置于离心管的土壤中心，称取3g相同土壤覆盖种子，采用移液枪向土壤中缓慢添加10ml纯净水，之后将离心管放置于人工温室中培养植物，根据离心管中土壤干湿度及时添加水分，且要一次浇透；
(4)添加标记氨基酸:培养15-35天后，植物根系长满整个离心管，离心管中土壤均为根际土壤，选取土壤含水量相对较低的时期，采用2mm直径的铁棒从上到下垂直打三个小孔，采用移液枪向土壤中添加含200 ymolL 1的13C，15N-Glycine溶液10ml，土壤含水量较低，可以使添加的含甘氨酸的液体迅速扩散均匀，垂直打三个小孔，有利于添加的液体上下均匀扩散；
(5)土壤植物样品处理及测定:吸收4h后迅速将植物连同土壤从离心管中取出，将土壤与根系分离开来后，迅速用自来水冲洗根系，之后在超声波中清洗5min，用0.5molL 1氯化钙冲洗三次，纯净水冲洗三次，最后放置于冻干机冷冻干燥后，称重，用球磨仪粉碎，样品高温消煮氧化，全氮含量用半微量凯氏定氮仪蒸馈，最后用0.01 mol L-1硫酸滴定，采用同位素质谱仪测定植株不同部位的15N丰度值，在处理植物样品的同时，将土壤放于4°C冰箱中保存，之后测定土壤的理化性质如全氮、碱解氮、有机质、CEC、pH、土壤机械组成、水溶性各氮素类型含量、吸附态氨基酸含量等，与氨基酸吸收量进行线性相关分析，研究影响土壤氨基酸生物有效性的主要土壤因素，因培养一段时间后受根际环境的影响，土壤理化性质会发生较大变化，而添加的标记氨基酸的吸收是在理化性质改变后，因此测定这些土壤理化指标采用的是培养后的土壤。
[0005]本发明方法操作简单，通过相关性检测可以在复杂的因素中找到对氨基酸生物有效性显著影响的因素，对研究及调控氨基酸的生物有效性提供了方法基础。
【附图说明】
[0006]图1是氨基酸吸收量与土壤全氮含量的关系。
[0007]图2是氨基酸吸收量与土壤碱解氮含量的关系。
[0008]图3是氨基酸吸收量与土壤pH的关系。
[0009]图4是氨基酸吸收量与土壤有机质含量的关系。
[0010]图5是氨基酸吸收量与土壤氨氮含量的关系。
[0011]图6是氨基酸吸收量与土壤硝态氮含量的关系。
[0012]图7是氨基酸吸收量与土壤氨基酸含量的关系。
【具体实施方式】
[0013]本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
[0014]实施例1
(1)土壤样品采集:采集具有代表性的地带性土壤15个，采集点位于典型的土壤类型带，砖红壤位于海南海口，赤红壤位于广东湛江，红壤位于江西上饶(两个样品)、广西南宁，黄棕壤位于河南社旗，黄壤位于贵州安顺，紫色土位于四川遂宁(两个样品)，潮土位于河南民权，褐土位于山西长治，棕壤位于山东烟台和沈阳铁岭，暗棕壤位于吉林桦甸，黑土位于哈尔滨，取样时先用?产子去除表土的枯枝落叶层，取0-15cm的表层土壤5kg，同时准确记录取样点位置及种植制度和植被类型；
(2)样品前处理:样品挑出石块及根系后，过4mm筛后放置于通风干燥处风干，之后研磨过2mm筛，装袋备用； (3)植物种植:称取47g风干土壤样品，放置于50ml离心管中，轻微震荡离心管，避免出现空隙，该离心管直径为25mm，高度为120mm，取预先放置于培养皿中发芽的植物种子，放置于离心管的土壤中心，称取3g相同土壤覆盖种子，采用移液枪向土壤中缓慢添加10ml纯净水，之后将离心管放置于人工温室中培养植物，根据离心管中土壤干湿度及时添加水分，且要一次浇透；
4)添加标记氨基酸:培养25天后，植物根系长满整个离心管，离心管中土壤均为根际土壤，选取土壤含水量相对较低的时期，采用2mm直径的铁棒从上到下垂直打三个小孔，采用移液枪向土壤中添加含200 ymolL 1的13C，15N_Glycine溶液10ml，土壤含水量较低，可以使添加的含甘氨酸的液体迅速扩散均匀，垂直打三个小孔，有利于添加的液体上下均匀扩散;
(5)土壤植物样品处理及测定:吸收4h后迅速将植物连同土壤从离心管中取出，将土壤与根系分离开来后，迅速用自来水冲洗根系，之后在超声波中清洗5min，用0.5molL 1氯化钙冲洗三次，纯净水冲洗三次，最后放置于冻干机冷冻干燥后，称重，用球磨仪粉碎，样品高温消煮氧化，全氮含量用半微量凯氏定氮仪蒸馈，最后用0.01 mol L1硫酸滴定，采用同位素质谱仪测定植株不同部位的15N丰度值，在处理植物样品的同时，将土壤放于4°C冰箱中保存，之后测定土壤的全氮含量，采用线性拟合方程研究氨基酸吸收量与土壤全氮的关系，并进行显著性检验；
从图1可以看出，分子态氨基酸的吸收量与土壤中全氮无显著线性相关关系，但因其R2=0.44，接近达到显著性差异，因此认为土壤中全氮对分子态氨基酸具有一定的影响。
[0015]实施例2
(1)土壤样品采集:采集具有代表性的地带性土壤15个，采集点位于典型的土壤类型带，砖红壤位于海南海口，赤红壤位于广东湛江，红壤位于江西上饶(两个样品)、广西南宁，黄棕壤位于河南社旗，黄壤位于贵州安顺，紫色土位于四川遂宁(两个样品)，潮土位于河南民权，褐土位于山西长治，棕壤位于山东烟台和沈阳铁岭，暗棕壤位于吉林桦甸，黑土位于哈尔滨，取样时先用?产子去除表土的枯枝落叶层，取0-15cm的表层土壤5kg，同时准确记录取样点位置及种植制度和植被类型；
(2)样品前处理:样品挑出石块及根系后，过4mm筛后放置于通风干燥处风干，之后研磨过2mm筛，装袋备用；
(3)植物种植:称取47g风干土壤样品，放置于50ml离心管中，轻微震荡离心管，避免出现空隙，该离心管直径为25mm，高度为120mm，取预先放置于培养皿中发芽的植物种子，放置于离心管的土壤中心，称取3g相同土壤覆盖种子，采用移液枪向土壤中缓慢添加10ml纯净水，之后将离心管放置于人工温室中培养植物，根据离心管中土