一种用于分型检测幽门螺杆菌感染的蛋白芯片的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种用于分型检测幽口螺杆菌感染的蛋白忍片，属于生物忍片技术领 域。
【背景技术】
[0002] 幽口螺杆菌化P)能在人体内生长、繁殖，又能经粪便、唾液排除体外，通过口-口 传播，粪-口传播、内窥镜传播、密切接触等途径在人群中传播。在发展中国家，近80%未满 10岁的儿童和超过90%的成年人被感染。
[0003] 经过多年研究发现化的细胞毒素相关蛋白AKagA)、细胞空泡毒素A蛋白（VacA) 和尿素酶OJre)等蛋白能够刺激机体产生强烈的免疫反应，在化感染患者的血清中可检 测到相应的抗体。对运些抗原的抗体进行联合检测，不仅能提高对幽口螺旋杆菌检测的敏 感性、特异性，而且能够获得更多的感染病原体相关信息，为临床医生的诊断和治疗提供帮 助。
[0004] 依据分泌毒素的情况不同，可W将化分为能产生毒素的I型菌株和不能产生毒素 的是II型菌株。I型化菌株感染引起的疾病主要包括：慢性浅表性胃炎、萎缩性胃炎、慢性 胃炎和十二指肠溃瘍W及胃癌等多种消化道疾病，还可能引起口臭、性疾病、皮肤病等其他 相关疾病。除此之外，I型化感染还是胃粘膜相关淋己组织淋己瘤发展的一个重要因素， 与MLT淋己瘤及胃癌的发生密切相关。II型化菌株由于不能产生细胞毒素，毒力低，感染 后一般只引起慢性浅表性胃炎。 阳00引人类感染化后，在血液和胃液中产生特异性IgG、IgM和IgA抗体，可用于化感染 的血清免疫学诊断。
[0006] 幽口螺杆菌的临床或实验室诊断方法主要有："c和1化尿素呼气实验、直接涂片、 细菌分离培养、快速尿素酶实验（RUT)、病理学组织切片染色、血清免疫学方法等。其中"C 和1?尿素呼气实验为检测"幽口螺旋杆菌"的"金标准"，但是该方法只能检测是否感染幽 口螺杆菌而无法判断感染情况并且检测费用比较高；直接涂片、细菌分离培养、快速尿素酶 实验（RUT)、病理学组织切片染色需要通过胃镜取材，属于创伤性，检测病人痛苦大，不易接 受，存在取样不准确导致的假阳性；血清免疫学方法主要有酶联免疫吸附试验巧LISA)、补 体结合法、免疫印迹法、乳胶凝集试验和血凝试验，其中W化ISA法最为常用。ELISA法准确 率高达90%~95%。目前普遍认为，ELISA检测外周血的抗化IgG的灵敏度高、特异性高、 重复性好，易于推广应用，但是一次只能检测一个检测项，检测时间较长；胶乳凝集试验，用 结合在胶乳颗粒上的化检测微量血中的抗体，优点是不需仪器，血样需量少，结果需要经 验，且准确性不满意；Western-blot主要用于分析感染者血中对化多种抗原组分的抗体产 生情况，可W控制抗原制备质量和分析与其他类似菌的交叉反应但操作复杂，技术难度大 且不稳定，不作常规诊断方法。
[0007] 目前已获得上市的与产品类似的主要有幽口螺杆菌抗体检测试剂盒（胶体金 法）；幽口螺杆菌尿素酶抗体检测试剂盒（胶体金法）；幽口螺杆菌IgG抗体检测剂盒（胶 体金法）。上述产品所使用的检测抗原或为单一的化e蛋白（如金标法），仅能检测患者血 清中的抗化e抗体，因此阳性率有限；或为混合抗原只能检测幽口螺杆菌是否感染，无法判 断是I型和II型感染。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种用于分型检测幽口螺杆菌感 染的蛋白忍片。
[0009] 本发明的用于分型检测幽口螺杆菌感染的蛋白忍片，包括基膜和W点阵的形式分 别点在基膜上的抗原，所述的抗原有Ξ种：CagA抗原、VacA抗原和化e抗原。
[0010] 所述的基膜上还固定有阴性对照和反应对照。
[0011] 含有本发明的用于分型检测幽口螺杆菌感染的蛋白忍片的试剂盒，包括： 阳01引1)洗涂液：由TBE和饱和硫酸锭溶液组成；
[0013] 2)显色剂：葡萄球菌A蛋白胶体金标记物；
[0014] 扣蛋白忍片。
[0015] 本忍片是W患者血清为样本，可W同时检测受试者是否感染化gA、VacA和化e3 种抗体，从而判断为几型感染，更利于临床医生的诊断和治疗。
[0016] 区别于目前已获得上市的与产品类似的主要有幽口螺杆菌抗体检测试剂盒（胶 体金法）；幽口螺杆菌尿素酶抗体检测试剂盒（胶体金法）；幽口螺杆菌IgG抗体检测剂盒 (胶体金法）。本发明与上述试剂盒的不同之处在于：上述产品所使用的检测抗原或为单一 的化e蛋白（如金标法），仅能检测患者血清中的抗化e抗体，因此阳性率有限；或为混合抗 原只能检测幽口螺杆菌是否感染，无法判断是I型和II型感染。而本发明使用的检测抗原 为化e、化gA、VacAS种单一蛋白，可同时检测针对患者血清中针对Ξ种抗原的特异性IgG 抗体，从而可W判断是I型或II型感染，更有利于临床治疗，此外本产品还具有检测敏感度 高，快速简便、立等可读，抗原用量少等优点。
【附图说明】
[0017] 图1是本发明的用于分型检测幽口螺杆菌感染的蛋白忍片16点阵模式的示意图。 0为反应对照探针，1为化gA检测项，2为VacA检测项，3为化e检测项，4为阴性对照探针， 检测项共同阴性对照探针为pRSET-A质粒转染的化21菌裂解液。
【具体实施方式】 阳01引实施例1制备蛋白忍片
[0019] 具体包括如下步骤：
[0020] 1.制备NC膜片 阳02U (1)将孔径为0. 45μπι的NC膜先用蒸馈水浸泡，取出凉干，用0. 05mol/L碳酸盐缓 冲液浸泡后凉干。 阳02引 似用半自动裁膜机将NC膜切割成0. 9cmX0. 9cm的方化备用。 阳02；3] (3)取稀释好的 0. 5mg/ml的CagA抗原、1.Omg/ml的VacA抗原、1.Omg/ml的Ure 抗原分别放入点样仪中相应的样品盒内。
[0024] (4)在控溫（《10°C)条件下，将硝酸纤维素膜平坦地放置于点样槽内，用 MicroGrid-2点样仪将抗原溶液、定位溶液W及质控对照溶液W点阵的形式点于硝酸纤维 素膜上，每3个点为一组。点样直径应控制在0.8+0.1mm，点间距为0.8mm。产品W硝酸纤 维（NC)膜为基质，采用16点阵模式点样，如图1所示。 阳0巧](5)点样完毕后，用2%BSA封闭溶液封闭处理NC膜，用蒸馈水清洗Ξ次，每次lOmin，再干燥，备用。
[0026] 2.组装蛋白忍片
[0027] (1)壳体筛选：检查忍片壳体表面有无划痕、残缺、或变形，油漆是否均匀，如有此 类现象的壳体一律放入次品售内