一种用于检测盐酸赛庚啶的酶联免疫试剂盒的制备
【技术领域】
[0001]本发明属于检测技术领域，具体地涉及一种用于定量检测猪尿样本中的盐酸赛庚啶残留量的酶联免疫试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002]盐酸赛庚啶是H1受体拮抗剂，属于抗组胺药，但同时也是5—羟色胺受体拮抗剂，是合法的人用药品，对抗体内组胺对血管、支气管平滑肌的作用，从而消除过敏症状，也可用于改善患者的食欲。盐酸盐酸赛庚啶用于养殖业可以促进动物生长，其具有抗5-羟色胺的作用，可抑制下丘脑的饱觉中枢而刺激食欲增加体重，因此一些畜牧养殖企业将其作为非法饲料添加剂用于促进畜禽生长。盐酸赛庚啶在动物体内的残留可对人体健康产生危害。2010年12月农业部1519号公告《禁止在饲料和动物饮水中使用的物质》中明确规定，禁止使用该类药物作为生产促进剂用于畜禽养殖，同年，农业部公布了“饲料中可乐定和盐酸赛庚啶的测定液相色谱一串联质谱法”。目前国外已有对人的血液和尿液中盐酸盐酸赛庚啶进行检测的方法报道，主要为高效液相色谱法和液相色谱一串联质谱法，本实验室也曾建立液相色谱一串联质谱法检测饲料中违法添加的盐酸盐酸赛庚啶含量的分析方法，但目前国内外尚无动物可食用组织及猪尿中盐酸盐酸赛庚啶的检测标准。
[0003]目前，检测盐酸赛庚啶的方法主要有高效液相色谱法HPLC、气相色谱法GC等。其中，高效液相色谱法HPLC、气相色谱法GC是定量的检测方法，结果准确可靠，缺点是检出限较高、仪器设备较为昂贵，以及复杂的样本前处理方法，限制了该方法的广泛应用。酶联免疫吸附ELISA法是一种准确、可靠、快速、特异的检测方法，适合于大批样品的快速筛选，近年来已广泛应用。本发明旨在建立一种检测猪尿中盐酸盐酸赛庚啶的ELISA试剂盒的制备及检测方法。
【发明内容】
[0004]针对现有技术中存在的问题，本发明提供了检测盐酸赛庚啶的ELISA试剂盒，其检测灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的检测。本发明提供了一种用于检测盐酸赛庚啶的ELISA试剂盒的制备。
[0005]检测盐酸赛庚啶的ELISA试剂盒的制备，包括酶标板、盐酸赛庚啶标准品、盐酸赛庚啶酶标抗体工作液、底物液A、底物液B、终止液和浓缩洗涤液。
[0006]检测盐酸赛庚啶的ELISA试剂盒的制备，包括以下步骤:酶标板的制备、盐酸赛庚啶标准品的制作、盐酸赛庚啶酶标抗体工作液的制备、洗涤液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备。
[0007]其进一步特征在于:所述的盐酸赛庚啶包被抗原是将盐酸赛庚啶半抗原与载体蛋白偶联得到的，该载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA);用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将盐酸赛庚啶抗原稀释成1:40000比例，100 μ?/孔，37°C放置2 h，取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300 μ?7孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，150 μ?7孔，37°C放置1.5 h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25°C )晾干；抽检合格后将酶标板真空密封后置4°C下保存。
[0008]所述的盐酸赛庚唆标准品浓度分别为0 ppb、0.1 ppb、0.3 ppb、0.9 ppb、2.7 ppb、
8.1 ppbo
[0009]盐酸赛庚啶酶标抗体工作液的制备:采用辣根过氧化酶偶联盐酸赛庚啶单克克隆抗体所得到，该酶标抗体工作液用抗体稀释液稀释成1:20000。
[0010]所述底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液；所述终止液为2 mol/L的硫酸；所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其包含0.5%吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。
[0011]盐酸赛庚啶的ELISA试剂盒的检测方法，基于抗原抗体进行直接竞争酶联免疫反应，该方法包括以下步骤:
(1)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品，并将其复溶于样品稀释液工作液中；
(2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20?25°C)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；
(3)取包被有盐酸赛庚啶抗原的酶标板，加标准品/样本50μ?7孔到对应的微孔中；
(4)加入酶标抗体工作液，50μ?7孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25°C避光环境中反应30 min ；
(5)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液300μ?7孔，充分洗涤4次，浸泡15-30 s,用吸水纸拍干；
(6)加入底物液A50 μ?ν孔，底物液B 50 μ?ν孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15 min ；
(7)加入终止液50μ?/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处或双波长450/630nm检测，测定每孔吸光度值(请在5 min内读完数据)；
(8)以标准品测试的吸光度值与标准品的浓度对数值绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中盐酸赛庚啶的含量。
[0012]其中，所述处理后的样品是经过以下处理的样品:
取5 mL样品于干净的玻璃试管中，加入2mL色谱纯的正己烷，盖上盖后振荡3 min，然后静置，待分层后取上层清液1 mL，于干净的玻璃器皿室温氮气吹干，吹干后用lmL 35%的甲醇复溶后待测。
[0013]本发明采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法来检测。用于检测盐酸赛庚啶的ELISA试剂盒的测定原理:样品中的盐酸赛庚啶与酶标板上固定的抗原特异性竞争酶标抗体，通过酶催化显色剂显色，根据显色的深浅来判断样品中盐酸赛庚啶的含量。如果样品中的盐酸赛庚啶含量少，显色深；反之，则显色浅。本发明的试剂盒检测方法操作简便，检测灵敏、准确、快速，适用于大批量样品的检测。
【附图说明】
[0014]图1为盐酸赛庚啶标准曲线图。
【具体实施方式】
[0015]检测盐酸赛庚啶的ELISA试剂盒，其包括酶标板、盐酸赛庚啶标准品、盐酸赛庚啶酶标抗体工作液、底物液A、底物液B、终止液和浓缩洗涤液。
[0016]下面具体描述本发明中检测盐酸赛庚啶的ELISA试剂盒的制备，
盐酸赛庚啶蛋白质偶联物的制备:
将盐酸赛庚啶半抗原与载体蛋白BSA按12:1的结合比混合在0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)中，然后加入入碳二亚胺，搅拌1?2h，置室温反应24 h，最后用0.2mol/L pH 7.6的PBS透析两天，除去未反应的半抗原，即可得到盐酸赛庚啶蛋白质偶联物。
[0017]盐酸赛庚啶抗体的制备:
选用3月龄健康大白兔，通过三次免疫，每次盐酸赛庚啶蛋白质偶联物免疫原用量为50 μδ/0.05 mL，每次免疫间隔时间为2周。初次免疫分别将免疫抗原与费氏佐剂及不安全佐剂等量混合，劲部皮下多点注射，二次、三次免疫直接注入腹腔。融合前3天每只腹腔注入25 Pg盐酸赛庚啶蛋白质偶联物进行加强免疫，免疫后第6 d耳静脉取血，采用直接竞争ELISA法测定效价。取得较高效价后用半抗原直接在大腿肌肉注射，8 d后颈动脉采全血，分离抗血清，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，制成冻干粉后于-20°C保存备用。
[0018]制备辣根过氧化物酶标记盐酸赛庚啶单克隆抗体:采用过碘酸盐氧化法。
[0019]制备包被有盐酸赛庚啶包被抗原的酶标板:
酶标板包被盐酸赛庚啶抗原，包被抗原是将盐酸赛庚啶半抗原与载体蛋白偶联得到的，该载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA);用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将盐酸赛庚啶抗原稀释成1:40000比例，100 μ?/孔，37°C放置2 h，取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300 μ?/孔，洗板2次，30 s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，150 μ?7孔，37°C放置1.5 h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25°C )晾干；抽检合格后将酶标板真空密封后置4°C下保存。
[0020]所述的盐酸赛庚唆标准品配制浓度分别为0 ppb、0.1 ppb、0.3 ppb、0.9 ppb、2.7
ppb、8.1 ppbo
[0021]所述的盐酸赛庚啶酶标抗体工作液的制备:采用辣根过氧化酶偶联盐酸赛庚啶单克克隆抗体所得到，该酶标抗体工作液用抗体稀释液稀释成1:20000。
[0022]所述底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；所述底物液B为四甲基