用于定量检测尘螨过敏原的酶联免疫试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种用于检测尘螨过敏原的酶联免疫试剂盒，具 体是涉及一种用于定量检测尘螨过敏原DerP2和Derf2的酶联免疫试剂盒。
【背景技术】
[0002] 尘螨是引起哮喘，过敏性皮炎和婴儿湿疹等多种变态反应性疾病的一种强烈过敏 原。DerP2是来自尘螨（Dermatophagoides pteronyssinus)的一种最主要的特异性过敏 原，80 % - 90 %对尘螨过敏的病人对该过敏原都有很强烈的反应。检测尘螨裂解液中DerP2 指标能够计算到空气中尘螨的含量，从而及时的预防过敏的发生，同时也为环境检测提供 数据支持。
[0003] 目前研发的检测螨类裂解液中过敏原的技术有毛细管电泳电化学检测技术和纳 米磁性粒子酶联免疫测定技术。已有实例显示毛细管电泳电化学检测技术可高效的分离和 检测粉尘螨制剂中DerP2含量，而纳米磁性粒子酶联免疫测定技术可以检测空气滤网和吸 尘器中的灰尘中尘螨过敏原DerP2和Derf2的含量。
[0004] 目前已有的相关检测技术中，毛细管电泳电化学检测技术需要非常专业且比较昂 贵的检测器，推广起来不是很方便，而纳米磁性粒子酶联免疫测定成本较高，用碱性磷酸酶 标记检测抗体进行检测灵敏性不够，因此采用夹心法ELISA，并且用生物素标记的抗体可以 方便，快捷，灵敏的实现检测尘螨裂解液中过敏原的含量，该技术成熟且应用平台广泛，推 广方便。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一个目的在于提供一种能识别尘螨过敏原DerP2的单克隆抗体。
[0006] 本发明所述的一种能识别过敏原DerP2的单克隆抗体，是由保藏号为CCTCC N0:C2014112的杂交瘤细胞株DerP2所分泌的。该杂交瘤细胞株DerP2保藏在武汉大学中 国典型培养物保藏中心（CCTCC)，地址是中国湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为2014年 5月29日。
[0007] 本发明的第二个目的在于提供一种用于检测定量检测尘螨过敏原DerP2和Derf2 的酶联免疫试剂盒，该试剂盒能通过本发明所述的能识别过敏原DerP2的单克隆抗体来检 测样本中的尘螨过敏原DerP2和Derf2,具有简便、快捷、实用、灵敏、高效的特点。
[0008] 本发明所述的一种用于定量检测尘螨过敏原DerP2和Derf2的酶联免疫试剂盒， 包括酶标板、标本稀释液、包被抗体、检测抗体、检测抗体稀释液、标准品、洗涤液、底物显色 液、终止液；包被抗体为本发明所述的能识别过敏原DerP2的单克隆抗体；检测抗体为已标 记HRP的抗DerP2多克隆抗体。
[0009] 根据本发明所述的用于定量检测尘螨过敏原DerP2和Derf2的酶联免疫试剂盒的 进一步特征，所述酶标板的包被抗体封闭液为PH7. 2,含5%脱脂奶粉的0. lmol/L的磷酸盐 缓冲液。
[0010] 根据本发明所述的用于定量检测尘螨过敏原DerP2和Derf2的酶联免疫试剂盒的 进一步特征，所述标本稀释液为15mM, pH6. 5的PBS缓冲液，溶质及其在所述标本稀释液中 的质量浓度或摩尔浓度或体积浓度如下：0.1-1%几丁质酶，2-4%蔗糖，150mM NaCl, 0.2% 吐温20。
[0011] 根据本发明所述的用于定量检测尘螨过敏原DerP2和Derf2的酶联免疫试剂盒的 进一步特征，所述检测抗体稀释液为15mM，pH7. 4的PBS缓冲液，溶质及其在所述抗体稀释 液中的质量浓度或摩尔浓度或体积浓度如下：〇. 5%酪蛋白，2-4%蔗糖，150mM NaCl，0. 2% 吐温20。
[0012] 根据本发明所述的用于定量检测尘螨过敏原DerP2和Derf2的酶联免疫试剂盒的 进一步特征，所述洗涤液为PH7. 2,含0. 5%吐温20、0. lmol/L的磷酸盐缓冲液。
[0013] 根据本发明所述的用于定量检测尘螨过敏原DerP2和Derf2的酶联免疫试剂盒的 进一步特征，所述底物显色液由显色液A和显色液B组成，显色液A液为过氧化氢，显色液 B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺。
[0014] 根据本发明所述的用于定量检测尘螨过敏原DerP2和Derf2的酶联免疫试剂盒的 进一步特征，所述终止液为2M硫酸溶液。
[0015] 本发明所述的能识别过敏原DerP2的单克隆抗体，是由保藏号为CCTCC N0:C2014112的杂交瘤细胞株DerP2所分泌的。
[0016] 本发明的第二个目的在于提供一种用于定量检测尘螨过敏原的酶联免疫试剂盒， 该试剂盒能检测空气中收集的样本里尘螨过敏原DerP2和Derf2,具有简便、快捷、实用、灵 敏、高效的特点。
[0017] 本发明以上单抗和多抗为核心试剂与常规试剂组合，制成了能检测DerP2的酶联 免疫试剂盒，结合上述酶联免疫方法，实现了对DerP2的酶联免疫检测。
[0018] 本发明所述试剂盒能同时检测不同种属的DerP2。
[0019] 本发明的有益效果是：
[0020] (1)本发明制备的单克隆抗体能识别与DerP2同类的过敏原，现有技术中还没有 抗体能同时识别DerP2和Derf2。
[0021] (2)本发明酶联免疫试剂盒操作简单，耗时少，灵敏度高，适合大量样品的快速检 测。
[0022] (3)该试剂盒成本低，易推广，能够进行定量检测空气中尘螨过敏原，从而可以检 测室内尘螨的污染状况，有助于提前预防相关过敏疾病如哮喘，过敏性鼻炎等的发生。
[0023] 本发明所述的针对过敏原诊断的抗DerP2单抗，是由杂交瘤细胞株DerP2所分泌， 杂交瘤细胞株DerP2的保藏号为CCTCC C2014112。该单抗具有良好的特异性，与DerPl蛋 白无交叉反应，可以以此为基础建立检测过敏原的体外诊断试剂盒，为临床与实践的不同 需要提供了建立快速、特异、敏感的检测方法。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明所述的用于定量检测尘螨过敏原的酶联免疫试剂盒的检测标准曲 线，显示该试剂盒的灵敏度。
[0025] 图2是本发明所述的用于定量检测尘螨过敏原的酶联免疫试剂盒的检测标准曲 线，显示该试剂盒的特异性。
[0026] 图3是本发明所述用于定量检测尘螨过敏原的酶联免疫试剂盒的样本测试相关 性曲线。
【具体实施方式】
[0027] 实施例1 :过敏原DerP2基因克隆表达及蛋白纯化
[0028] 1.过敏原DerP2基因核苷酸序列和重组表达的氨基酸序列。
[0029] 根据DerP2基因序列（Genbank登录号为AM263560)，设计引物，
[0030] 引物序列为：
[0031] 上游引物：GATCAAGTCGATGTCAAA
[0032] 下游引物：GCTAAAATCCGCGATTAA
[0033] 将DerP2基因克隆到表达载体pET28a上，用测序法验证该基因是否克隆成功。
[0034] 2、表达质粒的构建和高表达工程菌株的获得
[0035] 表达载体构建方法：通过PCR扩增得到目的DerP2基因，用Ndel+Xhol双切酶 PCR产物及pET28a质粒将两个片段用T4DNA连接酶进行连接，连接产物转化进入大肠杆菌 top 10,在含有卡那抗生素的LB平板上挑选单克隆，进行菌落PCR鉴定。通过菌落PCR鉴定 的阳性克隆挑至LB液体培养基过夜培养，少量抽提质粒，再通过双酶切和测序确定阳性克 隆菌株，完成表达载体的构建。
[0036] pET28a/DerP2质粒转化进入大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)，在含有卡那抗生素的 LB平板上挑选单克隆过夜培养，获得表达菌株，并将表达菌株保存。将过夜培养的表达菌株 按照120:4000比例转接新鲜培养基，培养至0D600到0. 6左右时，加入0. 5mM IPTG在30度 条件下培养12_16h，收集菌体。将菌体进行超声破碎，通过SDS-PAGE分别检测破碎后上清 和沉淀，检测目的基因表达情况。DerP2基因在沉淀中高量表达，表达量达到总蛋白的80% 左右。
[0037] 3、DerP2蛋白的纯化
[0038] 用 0· 5mM 的 Isopropyl β -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)诱导上述 DerP2 表 达菌株300mL，30°C培养16h。收集细菌并将菌体悬浮在悬浮液中，经溶菌酶破壁后，再采用 超声波破碎菌体，经离心（7500g，4°C)分离上清和沉淀。沉淀部分通过分别含有2M，4M，6M 尿素的包涵体洗涤液梯度洗涤，将洗涤成分通过SDS-PAGE鉴定。在4M尿素洗涤液里发现 DerP2以高量存在，为了获得纯度95%以上的蛋白，洗涤液再通过GE Healthcare公司的镍 柱进行亲和层析纯化。最后得到纯度在95%以上，产量高达5mg/100mL蛋白。
[0039] 表达的DerP2蛋白的氨基酸长度为129aa，为去掉信号肽（划线部分为信号肽序 列）后的成熟序列，表达范围为Aspl8-Aspl46,蛋白大小为16. 5KDa。
[0040] 实施例2 :过敏原DerP2单克隆抗体的制备
[0041] l、DerP2单抗细胞株的制备
[0042] 用上述纯化的DerP2蛋白免疫BalB/c小鼠：初次免疫时将弗氏完全佐剂与抗原 150 μ 1(50 μ g)等体积混合，充分乳化后，皮下多点注射。2周后，对小鼠进行再次免疫，并 改用弗氏不完全佐剂，注射体积和方法不变，此后每隔2周用同样方法对小鼠继续免疫，共 免疫3次。待小鼠血清效价达到要求后准备进行细胞融合，融合前三天对小鼠腹腔注射 50 μ g抗原进行冲击免疫。
[0043] 在免疫小鼠的同时准备小鼠骨髓瘤细胞SP2/0。
[0044] 将致敏的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，用HAT培养基进行选择性培养（以 小鼠腹腔巨噬细胞为滋养细胞）。
[0045] 接着，用ELISA方法检测杂交瘤细胞的培养上清：以纯化的DerP2蛋白1 μ g/ml包 被酶标板，每孔1 〇〇 μ I，4°C过夜。第二天洗涤3遍后，用5 %脱脂牛奶封闭，37 °C孵育2h。加 待测上清1〇〇μ 1，37°C孵育lh。洗涤6遍，加生物素化二抗（抗鼠 IgG-Biotin)，37°C孵育 lh。洗涤6遍，加入酶标记的