前列腺癌的恶性程度判定试剂盒和其方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请日为2007年02月06日、申请号为200780052524. 3、发明名称为"前 列腺癌的恶性程度判定试剂盒和其方法"的申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及用于判定（诊断）前列腺癌的恶性程度从而预测患者的预后的判定试 剂盒和判定法。
【背景技术】
[0003] LAT1基因是癌胚基因，在1998年由金井等人分离（Kanai，Y.，Segawa， Η·，Miyamoto，Κ·，Uchino，Η·，Takeda，Ε·，Endou，H. Expression Cloning and Characterization of a Transporter for Large Neutral Amino Acids Activated by the Heavy Chain of 4F2Antigen.J. Biol. Chem 273(37) :23629-23632,1998)。LAT1 基 因，编码具有L型氨基酸转运体功能的44KD的12次跨膜型蛋白质，在与1次跨膜蛋白 4F2hc (也称为⑶98)共存时，显示Na+非依赖性地转运亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨 酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、组氨酸等大型中性氨基酸的经典的L转运系统的活性。LAT1 和4F2hc蛋白可以认为是通过半光氨酸-半光氨酸键而结合。LAT1基因被证实在来源 于癌的培养细胞、胎肝中高量表达，在正常组织中仅在脑、胎盘、睾丸、骨髓等有限的部位 表达（Yanagida，0·，Kanai，Y.，Chairoungdua，A.，Kim，D，Kyung.，Segawa，H.，Nii，T.， Cha，S，Ho.，Matsuo，H.，Fukushima，J.，Fukasawa，Y.，Tani，Y.，Taketani，Y.，Uchino， H.，Kim，J，Young.，Inatomi，J.，Okayasu，I.，Miyamoto, K.，Takeda，E.，Goya，T.，Endou， H. ：Human L-type amino acid transporter 1 (LAT1) characterization of function and ezpression in tumor cell lines. Biochimica et Biophysica Acta 1514:291-302， 2001)。与此相对，4F2hc基因则在几乎全部的正常组织和癌细胞等中广泛地分布。
[0004] LAT1 的同系物 LAT2 (Segawa，H.，Fukasawa，Y.，Miyamoto, K.，Takeda，E.，Endou， H.，Kanai，Y. identification and Functional Characterization of a Na+independent Neutral Amino Acid Transporter with Broad Substrate Selectivity. J. Biol. Chem 274(28) :19745-19751,1999)与LAT1蛋白有50%氨基酸同源性，关于LAT2基因的人组织 分布，在所调查的所有组织中存在。因此，LAT1可以称为癌胚性的各种L型氨基酸转运体， LAT2可以称为正常型的各种L型氨基酸转运体。作为LAT的活性化因子的4F2hc几乎在全 部的组织中分布，癌组织与正常组织没有区别。
[0005] 然而，前列腺癌从世界范围看是发病频度尚的癌症，在美国男性的癌症中患病率 是第1位，死亡率是第2位。即使在日本，前列腺癌患者数近年来也有增加的趋势，在1975 年一年间的2千人左右的患者数在2000年则报告了约2万人，预计在2020年将达到约8 万人，在男性的癌症中仅次于肺癌，患病率达到第2位。另外，预测由前列腺癌导致的死亡 数在2020年将达到现在的1.4倍，预计在美国死亡率变为第1位（日本临床增刊号60; 44-48, 2002 ;前列腺疾患的临床）。
[0006] 作为前列腺癌的诊断法，血中PSA值的早期发现、筛选方法是著名的，并被广泛使 用，但是该方法对癌症没有特异性，已知即使在前列腺肥大、前列腺炎时也会升高。另外，在 近年，也有报道称血中PSA仅简单地与前列腺的大小成比例。通常，若确认血中PSA值为高 值，则通过直肠指诊确认前列腺的大小、硬度等。在通过上述检查强烈地怀疑发生前列腺癌 时，提取活组织进行检查，通过苏木素伊红（Hematoxylin eosin)染色，进行组织病理学的 诊断。在该诊断中，通过异形度（grade of atypism)、分化度等诊断细胞的状态，判断其恶 性的程度。在组织病理学的诊断中，Gleasons分类是前列腺癌特有的异形度分类，是根据 异形度的程度按评分1~5的5级进行分级的方法，近年来，该方法正成为对决定治疗方法 有着非常大的影响的诊断法。
[0007] 作为使用手术时摘出的材料进行的诊断，基于TMN分类（T:原发肿瘤，N :淋巴结转 移，Μ :远端转移）的诊断被认为是有效的。
[0008] 这些诊断法，特别是Gleasons分类，作为前列腺癌的预后判定方法被广泛地使 用，其与预后的联系也有报告，但是现状是在相关的领域中，为了更加精度高的诊断和治 疗，期待在Gleasons分类、TMN分期之外增加新的诊断法，特别是期待分子标记的出现。另 外，如上所述，TMN分类等如上所述是使用在手术时摘出的材料的诊断法，因此难以对早期 癌症的恶性程度进行诊断。
[0009]【专利文献1】日本特开平11-299489号公报
[0010]【专利文献2】日本特开2000-157286号公报
[0011] 因此，本发明的目的在于，提供在Gleasons分类、TMN分类之外作为新的诊断法的 分子标记的方法，同时提供通过与在手术前的早期阶段使用活体检验材料的Gleasons分 类组合，即使不使用手术时摘出的材料而使用细胞针检查所提取的材料时，也能够以更高 精度且容易地判定前列腺癌的恶性程度的方法。
【发明内容】
[0012] 为解决上述技术问题，本发明人等首先着眼于在来源于癌的培养细胞、胎肝中特 异性表达的氨基酸转运体LAT1。然后，在将该LAT1作为分子标记，研究使该LAT1显现化的 各种手法时发现，某种方法即使在使用基于细胞针检查提取的试样时，对于判定前列腺癌 细胞的恶性程度特异性地有效，从而完成了本发明。
[0013] 本发明（1)是含有抗人LAT1单克隆抗体、通过免疫组织化学染色用于判定前列腺 癌的恶性程度的试剂盒。在此，该抗人LAT1单克隆抗体只要是可以特异性地识别LAT1的 抗体就没有特别的限制，例如，可列举特异性地识别人LAT1的从细胞内区域的N末端部位 开始 1 ~52 位的氨基酸残基（Met Ala Gly Ala Gly Pro Lys Arg Arg Ala Leu Ala Ala Pro Ala Ala Glu Glu Lys Glu Glu Ala Arg Glu Lys Met Leu Ala Ala Lys Ser Ala Asp Gly Ser Ala Pro Ala Gly Glu Gly Glu Gly Val Thr Leu Gin Arg Asn lie Thr Leu)的 抗体（例如小鼠抗人LAT1单克隆抗体）。此外，人LAT1的氨基酸序列和碱基序列在日本特 开2000-157286号公报中记载。另外，针对本说明书中的"恶性程度"，将由于癌的原因造成 患者死亡的癌设定为恶性程度高的癌，将即使诊断为癌也不会以癌为直接原因造成死亡的 癌设定为恶性程度低的癌。
[0014] 在此，抗人LAT1单克隆抗体，只要是以LAT1为抗原与该抗原结合就没有特别的限 制，可以适当的使用小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体、羊抗体等。
[0015] 另外，产生单克隆抗体的杂交瘤，基本上可以使用公知技术，按以下所述制作。即 可以通过如下方法制作：将所需的抗原、表达所需的抗原的细胞作为致敏性抗原来使用，将 其按照通常的免疫方法进行免疫，利用通常的细胞融合法使得到的免疫细胞与公知的母细 胞融合，利用通常的筛选法，筛选产生单克隆抗体的细胞（杂交瘤）。杂交瘤的制作，例如 可以依照 Milstein 等的方法（Kohler. G. and Milstein，C.，Methods Enzymol. (1981)73 : 3-46)等进行。在制作抗人LAT1单克隆抗体时，可以将LAT1或其蛋白质的片断作为抗原 使用，另外，可