一种快速检测铅离子的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于重金属检测技术领域，涉及一种在线、快速检测重金属铅离子的一种方法。利用金纳米粒子为基础，构建了一种对重金属铅离子具有特异性识别功能的光学探针，通过铅结合蛋白与铅离子的特异性结合作用，成功构建出基于比色分析法的重金属铅离子传感器，实现对铅离子快速特异性检测。
【背景技术】
[0002]随着科技进步工业发展，环境污染和食品安全问题显现并日益加剧。重金属污染严重威胁到人们的生活健康和生态环境，所以重金属污染已成为最近关注的首要问题之一。设计灵敏性的工具和发明检测手段已经引起高度重视，很多方法和技术已经随着需要而逐渐发展而来。研究者们在利用功能材料作为探针，利用传感器检测化学和生物中重要离子已经投入相当大的努力。
[0003]纳米材料一般是指颗粒尺寸在100纳米范围之内的材料，由于特殊的介观尺寸，导致了其具有与常规材料所不同的性质。如纳米材料的量子尺寸效应，表面效应，量子隧道效应，小尺寸效应等。金属纳米材料的开发和应用是纳米科学和技术领域的一个重要的分支，金纳米粒子是目前纳米材料界最常用的材料。利用金纳米粒子特殊的表面等离子体共振光谱，使得金纳米离子作为一种灵敏的光学探针被应用于化学、生物、医学等多个领域，包括疾病的诊断，生物体内或体外成像，传感和纳米治疗等。金纳米材料因为其强表面等离子体共振吸收在可见光区，制备简单，高稳定性和生物兼容性成为最常用的光学传感纳米材料。由于金纳米材料的独特的尺寸和光学性能成为检测重金属离子的重要功能性材料之
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[0004]在过去十年发展过程中，包括基于原子吸收光谱法、原子荧光光谱法、电感耦合等离子体质谱和电化学传感器的一些重金属离子的检测方法，对于灵敏度和准确性，所有这些方法是有效的工具。然而，它们不仅耗时，而且昂贵，或者需要复杂设备。因此，需要开发一个简单而廉价能实时监控环境、生物和工业样品的重金属离子检测方法。金纳米粒子拥有强的表面等离子共振吸收，在可见光区有强消光系数。较小粒径的金纳米粒子(5-20nm)呈现红色，而较大的粒子或小粒子团聚呈现的颜色从紫色到深蓝范围。在溶液中利用表面配体与目标分析物结合可以控制金纳米粒子的团聚。当一个特定的分析物被引入，大量的金纳米粒子配位结合发生改变导致团聚随后溶液颜色发生改变。比色金属离子传感器通常基于金纳米粒子与不同的感应配体，如寡核苷酸、DNA酶、多肽、蛋白质和硫醇盐配体等发展而来的方法。基于我们之前的研究，我们发现这种检测重金属的方法具有高选择性和敏感性而且免标记、快速的优点，尤其针对于Hg2+，Pb2+,和Ag+。
【发明内容】
[0005]本发明所解决的技术问题是提供一种快速检测铅离子的方法，该方法操作方便，简单快捷，具有良好的特异性。
[0006]本发明利用对重金属铅离子具有特异性识别功能的铅结合蛋白与金纳米颗粒偶联，构建出重金属铅离子探针，利用铅金属离子与铅结合蛋白的特异性识别作用，可使传感体系的颜色改变，通过肉眼即可达到对铅金属离子的检测。本方法不局限于使用的时间和地点，通过肉眼直接读取实验结果，判定检测结果，定性定量检测重金属铅离子。
[0007]本发明是通过如下技术方案实现的:
[0008]本发明所述的快速检测铅离子的方法，包括如下步骤:
[0009](1)金纳米粒子的制备:
[0010](2)铅特异性结合蛋白的制备:
[0011](3)铅特异性结合蛋白与金纳米粒子的偶联。
[0012]所述步骤(1)中，金纳米粒子为金球形纳米粒子或金棒状纳米粒子，所述的金纳米粒子采用如下方法制备:
[0013]金球形纳米粒子:100-200mL蒸馏水置于一定容量的三颈瓶中，加入0.75-1.5mL还原剂溶液(0.01?0.5g/mL)，搅拌并加热到20?100°C，加入2_4mL氯金酸储备液，调节pH值为9?11，反应25-35min。溶液成为粉红色，制备结束。保存于4°C备用。
[0014]金棒状纳米粒子:取2?10mL十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)贮备液0.08?
0.2M，100?500 μ L氯金酸储备液0.0025?0.02Μ，200?800 μ L还原剂溶液混合，20?37°C反应1?3小时，制得种子溶液。
[0015]取30?60mL CTAB储备液，加入1?3mL氯金酸储备液，200?500 μ L硝酸银溶液(0.005?0.02Μ)，200?500 μ L还原剂溶液(0.08?0.2Μ)，500?800 μ L盐酸，以及5?200 μ L种子溶液。在25?37°C温度下，反应10?20小时，制得棒状金纳米颗粒。
[0016]所述步骤(2)中铅特异性结合蛋白的制备，包括表达载体的构建、融合蛋白的诱导表达和分离纯化、凝血酶切割以及蛋白样品制备。
[0017](a)表达载体的构建
[0018]应用基因重组技术，以苏州金唯智生物科技有限公司全合成含目的基因的质粒为模板，设计上下游引物，PCR扩增得到目的基因。将表达载体和目的基因分别经过双酶切、T4连接酶酶连、热转化及测序后，获得序列完全正确的重组大肠杆菌。
[0019](b)融合蛋白的诱导表达和分离纯化
[0020]取测序正确的菌液按照1/100接种至400ml含50 μ g/ml Kanamycin的新鲜LB培养基的三角瓶中，于37°C，培养至0D为0.6?0.8，加入终浓度为0.166mM的IPTG，继续培养4h，结束发酵。离心收集菌体，进行SDS-PAGE分析。结果显示，目标蛋白在重组大肠杆菌内实现了可溶性表达。
[0021]将表达菌体重悬于Buffer A(20mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，ρΗ7.3)中，超声破碎、离心后，取上清，上样于由Buffer A平衡过的N1-1DA，再用Buffer B(20mmol/LTris-HCl, 500mmol/L NaCl，lOOmmol/L imidazole，pH7.3)洗去杂蛋白，最后通过 BufferC(20mmol/L Tris-HCl, 500mmol/L NaCl, 200mmol/L imidazole，pH7.3)洗脱，收集目标蛋白洗脱峰。经SDS-PAGE分析，结果显示，目标蛋白在Buffer C洗脱条件下达到电泳纯。
[0022](c)凝血酶切割及蛋白样品制备
[0023]因组氨酸标签可与各种金属离子形成较牢固的配位键，从而对实验造成严重干扰。为了消除这一影响，利用存在于组氨酸标签和目标蛋白之间的凝血酶切割位点，进行凝血酶切割实验。将蛋白样品与凝血酶按12.06mol:lU的比例混匀，37°C水浴，过夜。经Buffer A透析除咪卩坐后，再次上样于经Buffer A平衡过的Ni_IDA，收集透过峰。经SDS-PAGE电泳显示，重组蛋白切割前和切割后存在明显的位移差，表明凝血酶可以切除组氨酸标签。将收集到的透过峰，经超滤除盐、浓缩后，替换溶剂为HEPES (pH7.4)，即得目标蛋白样品，用于与金纳米颗粒的偶联。
[0024]所述步骤(3)中，所述的偶联为将步骤⑴得到的金纳米粒子溶液离心，去除上清液，加入缓冲液使其分散，再加入步骤(2)制备的铅结合蛋白溶液，超声，放置，离心。
[0025]铅特异性结合蛋白与金纳米粒子的偶联:取上述步骤(1)制备的金纳米粒子溶液吸取0.5-2mL置于EP管中。离心10000rpm/10-15min，去除上清液。分别加入缓冲液使其分散，再加入步骤(2)制备的铅结合蛋白溶液0.5-2mL，置于超声波清洗仪中超声。室温放置使金纳米粒子与铅结合蛋白充分结合。离心，去除未结合蛋白。
[0026]将如上偶联的得到的基于金纳米粒子的重金属铅离子传感体系用于对铅离子检测:分别加入不同浓度的铅离子储备溶液，超声，使蛋白与铅离子完全结合。加入5mM?30mM氯化钠盐溶液稀释体系至lmL，超声混匀，观察颜色变化。
[0027]本发明通过金纳米粒子与铅结合蛋白的结合，构建出铅离子光学传感器。这种传感器对于铅离子的检测灵敏度高，特异性好，而且简单方便，肉眼可识别。
[0028]本发明是基于目标检测分子引发纳米粒子聚集而产生颜色变化的比色分析法，比色分析法是纳米传感技术中最先发展起来的技术之一。采用比色分析法仅需要将纳米粒子表面进行功能化修饰使之能够选择性地对目标分子产生响应，直接通过肉眼或简单光谱仪进行检测，即能实现对目标分子的定量分析。这种操作简便且成本低廉的检测方法，已经被普遍应用于各种检测分析研究工作中。利用有机配体、抗体蛋白以及核酸适配体等分子对金纳米粒子进行功能化修饰后，在功能分子发现溶液中含有目标分子后，引起金纳米粒子的聚集，纳米粒子的聚集则引起溶液颜色发生显著性变化，因而这种比色分析法简单快速，且具有较高的选择性和灵敏度。
【附图说明】
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[0029]图1为铅光学传感器对不同浓度铅离子溶液的响应颜色变化照片。
[0030]可见光下传感体系随着铅离子浓度的增加体系颜色的变化照片。EP管从左至右:Au NPs-a2m ；Au NPs-a2m_NaCl ;Au NPs-a2m-Pb(0.01 μM)-NaCl ；Au NPs-a2m-Pb(0.05 μM)-NaCl ; Au NPs-2am_Pb(0.1 μM)-NaC1 ; AuNPs-2am-Pb(0.5 μ M)-NaCl ；Au NPs-a2m_Pb(1 μ M)-NaCl ；Au NPs-a2m_Pb(3 μM)-NaCl ；AuNPs-a2m-Pb(5 μM)-NaCl ；Au NPs-a2m_Pb(7 μM)-NaCl ；Au NPs-a2m_Pb(9 μM)-NaCl ；AuNPs-a2m-Pb(llμΜ) -NaCl ；Au NPs-a2m_Pb(13 μM)-NaCl ；Au NPs-a2m_Pb(15 μM)-NaCl