一种检测庆大霉素免疫亲和凝胶检测柱及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于小分子化合物免疫化学和残留分析技术领域，涉及免疫化学、酶学与分析化学技术等，尤其是涉及一种庆大霉素免疫亲和凝胶可视化检测柱的制备。
【背景技术】
[0002]庆大霉素是由绛红小单孢菌、棘孢小单孢菌等发酵产生的氨基糖苷类抗生素，易溶于水，呈碱性，性质稳定。主要作用于革兰氏阴性细菌，全程阻断细菌蛋白质合成，包括抑制始动期70S复合物形成，干扰DNA复制，影响肽链延伸等，改变细胞膜通透性，从而起到抑菌和杀菌作用。庆大霉素抗菌谱广、疗效好、价格低廉，因而被广泛应用于兽医临床，并作为动物饲料的添加剂被广泛使用。但是庆大霉素在血清中的有效浓度与毒性浓度比较相近，因而在实际应用过程中较易产生毒副作用。一些不规范使用过程，常常会导致动物源性食品中庆大霉素的残留超标，对人体的健康构成危害，引起耳、肾毒性，也可能引起过敏性休克。近年来欧盟、美国等发达国家已相继禁止庆大霉素用于动物源性食品，并明确规定庆大霉素残留限量为不得检出。我国农业部已禁止使用该药，无论内销还是出口的畜产品，庆大霉素残留都是必检项目。为保障人民健康及扩大与世界各国食品贸易往来，必须建立灵敏度高、特异性强、简单快速测定方法对庆大霉素残留进行监控。
[0003]目前报到的庆大霉素检测方法主要有:微生物法、仪器分析法、酶联免疫分析法、胶体金免疫层析分析法等。氨基糖苷类抗生素绝大多数无特征的紫外吸收，因此微生物效价法是当前各国药典测定该类抗生素含量的主要方法。微生物测定法价格低廉，所需仪器设备简单，但测定结果影响因素复杂，因此，随着各种新技术的发展，将会逐步被其它方法所取代。基于抗原抗体特异性反应建立起来的免疫学测定方法，一直是兽药残留快速检测和样品筛选方法的研究热点，其具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度较高、特异性强等诸多优点，具有广阔的应用前景。尤其是可视化快速免疫检测技术，如试纸条，不需任何仪器设备，几分钟就可用肉眼观察实验结果，非常适合于大量样品的现场筛查和基层推广。然而试纸条检测也易受样品基质的影响，在不同食品样品检测中受到一定限制。本发明阐述的凝胶柱免疫检测产品为庆大霉素在食品样品中的残留检测分析提供一种行之有效的可视化定性半定量快速简单检测方法，为食品安全的有力监管提供可靠的技术保障。
【发明内容】
[0004]本发明提出一种可以定性半定量的检测食品中的庆大霉素的简单、省时、灵敏可视化的免疫亲和凝胶检测柱产品，只要样品中含有酶标记抗原，凝胶检测柱的质控层就会出现蓝色，它可以确保检测柱可以正常检测，达到质控的作用。以凝胶检测柱的质控层为基准，通过检测层颜色深浅变化达到定性或半定量检测样品中的庆大霉素的目的。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:
[0006]庆大霉素抗体胶的制备:
[0007]CNBr活化的琼脂糖凝胶0.25g使用lmmol/L HC1 20mL在具砂板层析柱中溶胀清洗15min，待凝胶完全溶胀后用偶联缓冲液调至中性；用lmL偶联缓冲液稀释抗体含量为
0.5mg的缓冲液，在凝胶中悬起，室温下使用定向摇床振摇2h。之后使用10mL偶联缓冲液清洗凝胶，去除未偶联上的抗体；用甘氨酸封闭液将凝胶上的残余活性基团封闭，室温下在定向摇床振摇反应2h。反应完后清洗凝胶至少三次以调整其pH，每次清洗先用10mL醋酸钠缓冲溶液清洗，再用10mL偶联缓冲液清洗。制备好的凝胶用含有0.03% Proclin300的PBS以1:3 (v/v)稀释重悬，4°C贮存。
[0008]HRP抗体胶的制备:
[0009]将兔抗HRP多克隆抗体与凝胶偶联，用于凝胶检测柱的质控层。偶联步骤同庆大霉素抗体胶。
[0010]封闭胶的制备:
[0011]使用封闭的凝胶稀释抗体胶对抗体胶起物理支撑和分散的作用。制备过程如下:使用lmmol/L HC1 80mL将CNBr活化的琼脂糖凝胶lg在具砂板层析柱中溶胀15min，待凝胶完全溶胀后用偶联缓冲液调至中性。然后加入20mL甘氨酸封闭液室温反应2h，以封闭凝胶上残余的基团。清洗和重悬步骤同抗体胶的制备过程。
[0012]所述封闭胶和抗体胶按一定比例混合制备凝胶检测柱的质控层和检测层，即:
[0013](1)质控层是由HRP抗体胶与封闭胶以一定比例混合好后，取200 μ L混合胶加入到lmL的SPE塑料柱中，用注射器活塞将PBS压出；
[0014](2)检测层是由优化好的抗体胶与封闭胶以一定的比例混合好后，取200 μ L加入其中，用注射器活塞将PBS压出；
[0015]进一步的，所述质控层和检测层，制备检测柱，即:
[0016](1)检测柱由下到上，分别是对照层和检测层，对照层和检测层之间隔开一个3mm的空气层，可以防止加入底物显色后试剂和颜色从对照层迀移到检测层中。
[0017](2)首先将聚乙烯垫片加入lmL的塑料柱中，然后加入对照层混合胶，加入第二层聚乙烯垫片，在对照层上方约3mm处加入第三层聚乙烯垫片，然后加入其检测层的混合胶，最后在顶部加入第四层垫片。
[0018]本发明创造所述的免疫检测柱相对于现有技术具有以下优势:
[0019](1)本发明提供的庆大霉素免疫亲和凝胶检测柱，可专一识别庆大霉素，具有非常尚的选择性。
[0020](2)本发明庆大霉素免疫亲和凝胶检测柱是一种可视化的定性半定量检测产品。对目标待测物的检测，检测柱会以检测层颜色的有无给出检测结果，即以是/否的可视定性信号给予应答，操作方便，结果判断简单。
[0021](3)本发明制得的庆大霉素免疫亲和凝胶检测柱既可以使之与净化柱串联，消除样品基质影响；又可容纳较大体积的清洗缓冲液和样品溶液，提高了方法灵敏度。检测产品不需要任何复杂的前处理，及大型仪器的辅助，具有很好的易用性和准确性，满足现场快速检测的要求。
【附图说明】
[0022]构成本发明创造的一部分的附图用来提供对本发明创造的进一步理解，本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中:
[0023]图1为本发明创造实施例所述的凝胶检测柱的组装示意图；
[0024]1-注射器，2-转接头，3-进样口，4-聚乙烯垫片，5-检测层，6-空气层，7-质控层，8-出口。
[0025]图2为本发明创造实施例所述的庆大霉素凝胶检测柱检测限的判定(庆大霉素浓度从左向右依次为:0，l，5，10yg/L)。
[0026]图3为本发明创造实施例所述的食品样品中庆大霉素凝胶检测柱检测结果的判定，庆大霉素添加浓度(a)牛奶:0，100yg/L，(b)猪肉:0, 100 μ g/kg, (c)牛肉:0, 100 μ g/kg, (d)鸡肉:0, 100 μ g/kg;
【具体实施方式】
[0027]下面结合实施例，对本发明进一步说明；下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施来限定本发明的保护范围。
[0028]下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明创造。
[0029]实施例1
[0030]1、庆大霉素抗血清的纯化
[0031]采用Protein A — Sepharose 4B作亲合层析介质纯化庆大霉素抗血清，可一次性获得接近纯度较高的特异性抗体。具体操作步骤为(1)平衡:用平衡缓冲液(0.2mol/L的磷酸缓冲液)冲洗管路，平衡柱子，至基线平稳。(2)上样:用平衡缓冲液将庆大霉素特异性抗血清等体积稀释后上柱。(3)洗杂:用平衡缓冲液洗杂至杂蛋白的紫外吸收峰出现后继续冲洗至基线平稳。(4)洗脱收集:用0.lmol/L pH 2.7的甘氨酸缓冲液洗脱特异性IgG抗体。当紫外吸收曲线呈上升趋势，收集特异性抗体。并迅速用Tris-HCl中和抗体至中性。(5)封柱:抗体收集完成后迅速用醋酸缓冲液酸化纯化柱后，用平衡缓冲液中和纯化柱，最后用20%乙醇饱和封柱。将纯化收集的抗体，用pH7.4的磷酸缓冲液4°C透析三天后取出，测定抗体蛋白浓度，添加0.1% (w/v)的叠氮钠，4°C储存备用。利用该抗体与活化琼脂糖凝胶结合制备庆大霉素抗体胶。
[0032]2、庆大霉素酶标抗原的制备
[0033]10mg HRP 溶于 2mL 50mmol/L 的 K2HP04(pH 9.3)溶液中，将 25 μ L 50%戊二醛加入500 yL双蒸水配制成2.5%的戊二醛水溶液，逐滴加入蛋白溶液中，4°C连续搅拌12h，PBS透析