检测肺炎支原体的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肺炎支原体感染患者病原体检测的技术领域，尤其涉及一种检测肺炎 支原体的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 肺炎支原体（Mycoplasmapneumoniae，MP)是全球各年龄段人类呼吸道感染的常 见病原体。它是支原体中唯一可导致呼吸道感染的病原体，引起上呼吸道感染、气管炎、支 气管炎、细支气管炎、社区获得性肺炎，并可加重支气管哮喘。MP还可引起诸多肺外表现及 全身性疾患，例如脑炎、格林巴利综合征、心包炎、关节炎、自身免疫性贫血、肾功能损害、哮 喘和Crohn's病等。快速准确的判断患者是否感染了肺炎支原体，对进一步判断患者的病 情和对症治疗具有极其重要的意义。
[0003] 目前临床上肺炎支原体的检查常用方法为分离培养法、PCR检测法、ELISA检测 法、免疫层析法等。这些检测方法灵敏度高，检测结果可靠，常作为临床确诊辅助手段，但设 备昂贵，样品前处理过程复杂，对操作人员要求高，耗时较长，不适合批量样品的快速检测。 胶体金免疫层析技术是一种新型的免疫标记技术，是在免疫层析的基础上建立起来的，以 胶体金为示踪物与抗原、抗体特异性反应相结合的一种检测技术。目前广泛应用ELISA检 测法和免疫层析法全部是检测IgG或IgM，由于人体产生抗体需要一定条件和时间，均具有 一定的滞后性和不准确性，无法实现快速、准确检测的目的。检测结果不能满足临床诊断的 需要。该检测方法结果判读简单，不需要专业的操作人员，检测时间短，携带方便，特别适合 大批量、快速、床旁检查诊断。
【发明内容】
[0004] 发明目的：本发明的目的在于提供一种特异性强、操作简便，检测快速、准确并适 合床旁使用的专门用于检测肺炎支原体的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法，以便对肺 炎支原体感染患者病原体进行高灵敏度、快速、早期的检测。
[0005] 技术方案： 为实现上述目的，本发明的技术方案是： 检测肺炎支原体的胶体金免疫层析试纸条，该试纸条包括依次搭接在PVC底板上的样 品垫、结合垫、硝酸纤维素包被膜、吸水垫，其特征在于：所述结合垫包被设有肺炎支原体抗 体MPh2-胶体金-碳纳米管标记物；所述硝酸纤维素包被膜上设有检测线和质控线；所述 检测线包被有肺炎支原体抗体MPhl，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。
[0006] 检测肺炎支原体的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：该制备方法 包括以下步骤： 1)胶体金的制备：于250mL烧杯中加入99mL纯水，于恒温磁力搅拌器上使用温度档 200°C对其进行加热，转速为200r/min;加热至沸腾状态后，沸腾时的实际温度为100°C，向 烧杯中快速加入lmL1%柠檬酸三钠溶液；1分钟后快速加入1%氯金酸溶液lmL，烧杯中的 溶液变为红色后再加热lOmin，直至溶液透亮，冷却至室温，100ml容量瓶定容，即制得胶体 金，于4°C密封保存； 2) 肺炎支原体抗体MPh2-胶体金-碳纳米管标记物的制备及纯化： 取调节pH值至8. 5的所述胶体金lmL于10.OmL烧杯中，向烧杯中加入10μg的肺炎 支原体抗体MP-h2,盖上薄膜密封，用磁力搅拌器混匀20min后静置lOmin; 向所述烧杯中加入l〇〇yL5%BSA溶液，用磁力搅拌器混匀20min，静置lOmin，制得 金标抗体； 继续加入5yL10%碳纳米管，继续混勾lOmin，即肺炎支原体抗体MPh2-胶体金-碳 纳米管复合标记物； 将制得的复合标记物溶液于4°C2500r/min，离心lOmin，去除下层沉淀，将上清液转 到另一离心管中，于4°C9500r/min，离心30min，去除上清液，将沉淀用胶体金稀释溶液稀 释至原浓度的1/20,于4°C保存备用； 3) 试纸条的组装： (1) 将硝酸纤维素包被膜和吸水垫分别贴于PVC底板上，吸水垫压住硝酸纤维素包被 膜上方1-2mm; (2) 将粘贴好硝酸纤维素包被膜和吸水垫的PVC底板在切条机上切割成4mm宽的试 纸条； (3) 将样品垫和结合垫切成4_宽的条，同时将结合垫浸泡在肺炎支原体抗体 MPh2-胶体金-碳纳米管标记物溶液中，并于37°C烘干，制得金标垫； (4) 烘干后的金标垫剪成lcm长的小块并贴于PVC底板上，金标垫压住硝酸纤维素 包被膜下方1_2_，同时用样品垫压住金标垫下方1_2_，根据试纸条长度修剪样品垫； (5) 在结合垫和吸收垫之间的硝酸纤维素包被膜上依次包被肺炎支原体抗体MP-hl 抗体和羊抗鼠IgG，分别作为检测线和控制线，采用金标划膜仪进行包被划线，具体参数为 平台移动速度40mm/s，单位喷量：检测线为0. 8μL/cm，质控线为1. 0μL/cm，使得肺炎支原 体抗体MP-hl包被浓度为1.Omg/mL;羊抗鼠IgG包被浓度为1.Omg/mL。
[0007] 所述的检测肺炎支原体的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：所述 胶体金的检验标准为通过紫外分光光度计测量最大吸收波长为525nm。
[0008] 所述的检测肺炎支原体的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：在所 述试纸条的组装步骤中的（3)中，还包括对样品垫和金标垫进行前处理的步骤，即将样品垫 与结合垫用切条机分别切成4_宽的长条，用含有5%的蔗糖、5%BSA和终体积浓度为 0. 1 %的pH为8. 5的0.Olmol/L的PBS溶液进行浸泡，浸泡后将溶液沥干，在37°C条件下 烘干12h备用。
[0009] 所述的检测肺炎支原体的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：该制 备方法还包括对容器的清洗，具体为：首先将试验所用容器在重铬酸钾洗液中浸泡24h，取 出后用自来水进行若干次清洗，再用超纯水清洗3次；将清洗干净的容器于二氯甲硅烷含 量为5%的氯仿中浸泡lmin后进行硅化处理；将经过硅化处理过的容器放置于室温条件 下干燥，待干燥完成后用超纯水清洗干净并于烘箱中37°C进行干燥处理，备用。
[0010] 优点及效果： 本发明具有特异性强，灵敏度高，检测时间短等优点；并且可以不受机体抗体产生因素 的影响，实现感染早期诊断。
[0011]
【附图说明】： 图1、图2为本发明胶体金免疫层析试纸条的结构示意图； 图3为本发明实施例4性能评价肺炎支原体纸条灵敏度测试结果图；其中，从左到右 添加的肺炎支原体培养液的浓度依次为0、10 \ 10 2、10 3、10 4; 图4为本发明实施例6性能评价肺炎支原体试纸条稳定性测试结果图；其中，样品添 加的浓度依次为〇、10 \ 10 2。
[0012]
【具体实施方式】： 本发明一种检测肺炎支原体的胶体金免疫层析试纸条，该试纸条包括依次搭接在PVC底板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素包被膜、吸水垫，其特征在于：所述结合垫包被设有肺 炎支原体抗体MPh2-胶体金-碳纳米管标记物；所述硝酸纤维素包被膜上设有检测线和质 控线；所述检测线包被有肺炎支原体抗体MPhl，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。本发明中使 用了碳纳米管，提高了检测灵敏度。
[0013] 本发明通过以下几个步骤的方法进行制备： 1)胶体金的制备：取1个250mL烧杯，于250mL三角烧瓶中加入99mL纯水，于恒温磁 力搅拌器上使用温度档200°C对其进行加热，转速为200r/min;加热至沸腾状态后，沸腾时 的实际温度为l〇〇°C，向烧杯中快速加入lmL1%柠檬酸三钠溶液；1分钟后快速加入1%氯 金酸溶液lmL，烧杯中的溶液变为红色后再加热lOmin，直至溶液透亮，冷却至室温，100ml 容量瓶定容，即制得胶体金，于4°C密封保存；胶体金的检验标准为通过紫外分光光度计测 量最大吸收波长为525nm。
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