一种利用同位素稀释质谱法测量糖化血红蛋白的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用同位素稀释质谱法测定糖化血红蛋白的方法，特别涉及一种 利用同位素稀释液相色谱串联质谱法准确测量待测样品中糖化血红蛋白含量方法。
【背景技术】
[0002] 糖化血红蛋白（缩写作hemoglobinAle、化Ak、AlC或化Ale)是血液红细胞中的 血红蛋白与葡萄糖结合的产物，可W反映测定前6-8周患者体内平均血糖水平，通常作为 评估糖尿病患者体内血糖控制情况与疗效观察的主要指标，一般来说血红蛋白被糖基化的 比例与一段时间内体内血糖浓度的水平成正比。对应的，非糖化血红蛋白用化A0表示。目 前，国际上定义化Ai。化学构成为葡萄糖稳定的连接在血红蛋白目链N末端鄉氨酸（Val) 残基上，即血红蛋白（血液）-N-(l-脱氧果糖基）血红蛋白目链（目N-1-deo巧化uctosyl -hemoglobin)。
[0003] 葡萄糖进入红细胞后与血红蛋白化A的目链N末端鄉氨酸残基缩合，先形成一 种不稳定的Schiff碱（醒亚胺结构），即前化Ai。，再解离或经Amadori分子重排后形成 化Ai。（醒丽结构），此反应的过程是缓慢和不可逆的，并且由于红细胞内没有分解醒丽的 酶，因此化Ai。浓度只与红细胞寿命和该时期体内血糖的平均浓度有关，不受运动或食物的 影响，反映的是过去6-8周的平均血糖浓度，是目前国际上公认的用于评估糖尿病患者长 期血糖状况的金标准。
[0004]目前有超过20种不同的方法用于测量化Ai。，其主要的检测原理主要有如下3种：
[0005] (1)离子交换层析法：它是基于不同组分的电荷差异进行分离的。葡萄糖与化 的目链N末端Val连接降低了等电点，导致糖化化带的正电荷比未糖化化的少，与树脂 的附着力小，可W分别用不同离子浓度的缓冲液在不同的时间将化从阳离子交换柱中洗 脱下来，再根据每个峰值下的面积来计算化Ai。占总化的比例。但是该方法中化变异体 会随化Ai。一起洗脱，影响化Ai。值，离子交换层析法受温度、抑值、抗凝剂和柱效的影响 较大，从而使结果产生偏差。常规的离子交换HPLC法经过多年技术上的改进，检测精密度 (CVK1%、分辨率及抵抗多种糖化血红蛋白变异体的能力有了明显提高，基本可W达到临 床需求，美国糖化血红蛋白标准化计划（NGS巧的参考实验室也是使用Bi〇-Rex70阳离子交 换树脂HPLC作为常规实验标准参考方法，但是非特异性的问题仍然不能完全克服。
[0006] (2)亲和层析法；用于分离糖化与非糖化血红蛋白的亲和层析凝胶柱是交联了间 氨基苯测酸的琼脂糖珠。测酸具有与整合在血红蛋白分子上葡萄糖的顺位二醇基作可逆结 合反应的性质，致使化Ai。选择性地结合于柱上，而非糖化血红蛋白被洗脱，然后变换条件， 又可W将化Ai。重新解离，获得纯化。除葡萄糖外，血液中其他糖类都可与测酸基结合，因此 该方法的检测结果为G冊总量，而不是化Ai。的含量，该方法不受温度、G冊变异体的影响， 通过校准，其结果与离子交换法有良好的相关性，已被临床广泛采用。但该实验测定结果受 到除血红蛋白目链N末端鄉氨酸残基W外糖基化的影响。
[0007] (3)免疫法：利用抗原、抗体反应的原理，使用单克隆或多克隆抗体与血红蛋白 目-链上糖基化的N末端的4-8个氨基酸作为抗体识别位点，发生凝集反应，通过吸光度 来测定凝集量，可用全自动生化分析仪进行检测。该抗原与IFCC参考系统用于制备一级 参考物质的目链N末端6个氨基酸肤端极为相似，其参考范围（2. 8%~4. 9%)比其他 方法更低，而与IFCC推荐的化85~3. 81 % )更为一致。但是，当化发生第6位氨基酸 变异出bS(目6glu-val)和化C(目6glu-lys)]时将不会被识别，有报道对此变异进行 实验显示，厂家间的检测结果存在着偏倚。2011年，参加卫生部临床检验中必化Ai。项目 的实验室中，离子交换高效液相色谱和免疫比浊法最为普遍，实验室所占比例超过45%和 25%，鉴于此，张传宝等对3个基于高效液相色谱和1个基于免疫比浊法原理的化Ai。测定 系统的精密度和正确度进行验证，免疫法批内精密度CV为0. 54%~1. 02%，室内精密度 CV为0. 54%~1. 17%;测定标准物质的均值（NGSP值）和标准物质定值的偏倚为-0. 34% HbAic~0. 18%HbAic，与IFCC定值导出的NGSP值的偏倚为-0. 14%HbAic~0. 05%HbAic， 批内精密度和实验室内精密度及正确度性能均符合相关要求，认为可W满足临床工作的需 要，具有广阔的应用前景。
[000引尽管化A1C标准化测定的问题早在1984年即已提出，但直到1993年DCCT的结 果发布后，才开始受到关注。美国、日本和瑞典等国家都分别建立了化Ai。国家标准纲要， 其中最为"著名"的是NGSP(NationalGlycohemoglobinStandardizationProgram)计 划。NGSP参考系统是WDCCT数值为基础，把NGSP参考实验室网络中各种实验方法都校准 为DCCT参考方法，并建议各实验室只能采用被NGSP认可的方法来检测化Ai。，使临床实验 室的检测结果与DCCT的检测结果更具有相关性，大大减少了各实验室之间的差异。
[0009]NGSP主要内容为；NGSP管理委员会下设由中必参考实验室、一级参考实验室 和二级参考实验室组成的参考实验室网络，其主要的职责为；（1)负责参与生产厂家的 仪器校准；（2)负责对实验室和厂家进行正确度认证；（3)对常规实验室进行能力验证 (proficien巧test,PT)。自NGSP计划建立W来，美国临床实验室间化Ai。测定的结果"从 混乱进入有序"状态，目前参加NGSP活动的实验室室间CV小于5%，化Ale结果与NGSP革己 值的偏倚小于8%，并且自2005年W后，参加美国病理工作者协会（CollegeofAmerican Pathologists,CA巧化Ai。室间质评的实验室，95 %W上均经过了NGSP认证，经过CAP和 NGSP两组织的共同监测，推进了临床实验室关于糖化血红蛋白的检测质量。
[0010] 1995年，日本糖尿病学会（JapaneseDi油etesSociety,JD巧采用HPLC方法制 备了国家级的校准品（JDSCalibratorlot1)，推荐用于所有的常规糖化血红蛋白检测方 法的定标，对化Ai。检测进行标准化，并且经过几年的努力，日本临床化学学会（Japanese SocietyofClinicalQiemistry,JSCC)采用K0500 制备了国家二级校准品（JDS/JSCC Calibratorlot2)，实现了标准物质的溯源性。瑞典临床化学学会（SwedishSocietyof Clinical化emistry，SFKK)将MonoSHPLC方法作为国家指定参考方法，推荐用于糖化血红 蛋白的标准化。具体实施内容为；每月一次，将己二胺四己酸巧DTA)抗凝的新鲜全血样本 发放至40家使用HPLC方法的临床医院，其中有5家医院采用MonoSHPLC参考方法，从而 达到对常规实验室的能力验证，并且作为重点关注的检验仪器，要求所有的医院每2年至 少对糖化血红蛋白仪器进行校准一次。
[0011] 上述国家级参考方法均采用离子交换色谱法，由于受树脂种类、柱子规格、缓冲液 组分、洗脱时间和色谱分辨率不同等原因的影响，检测结果也不同，在美国，DCCT和NGSP使 用指定的参比方法，应用Bi〇-Rex70HPLC和瑞典的MonoSHPLC方法检测化Ai。，在临界值 仍有20%的差异，显然在度量学方面，无法满足参考方法的要求。
[001引国际临床化学组织（IFCC)建立了化Ai。标准化工作组，旨在研究一个可供追溯的 参照系统，研发化Ai。参考物质和参考方法，该工作组历时5年的探索，经过多家实验室的 努力，于2002年推出了一套化Ai。参考方法，即将待测标本溶血后经胞内蛋白酶酶解，然后 应用高效液相色谱串联电喷雾质谱仪或高效液相色谱串联毛细管电泳仪，利用信号比例计 算出糖基化的B链N末端六肤片段的比例，从而得出化Ai。在样本中所占的百分比，是检测 化Ai。分子浓度的新方法。此方法已经由包括欧洲、日本和美国在内的11家IFCC参考实验 室验证。IFCC推荐的检测化Ai。方法的结果与DCCT的结果存在一定差异，其检测值较NGSP 的化Ai。检测值低，两个方法相关系数R为1.000,室内CV为0.47%~2. 07%，室间CV为 1. 35 %~2. 27%。但是IFCC推荐的检测化Ai。方法，实验操作比较复杂，耗时较长，仪器昂 贵、维护和保养成本较高，目前仍只限于糖化血红蛋白标准化的研究。
[0013] 由于我国目前化Ai。测定的方法、实验价格、地区医疗水平的差异等原因，化Ai。的 测定并未普及，化Ai。作为糖尿病诊断指标也存在亟须解决问题，主要是我国化Ai。检测方法 的标准化程度不够，测定的仪器和质量控制尚不能符合目前糖尿病诊断标准的要求，因此 目前暂不推荐应用化Ai。诊断糖尿病，但是为提高我国糖尿病的诊断、治疗、管理水平，2010 年3月，中国化Ai。教育计划在京启动，该计划是国内首次由内分泌和检验界专家共同参与 的大型学术活动，旨在提高化Ai。在糖尿病管理中的重要地位，加强临床医生对化Ai。的认识 和重视。
[0014] 我国化Ai。测定标准化工作起步较晚，目前仍处于初级阶段，但是国内的检验界学 者越来越重视糖化血红蛋白测定的量值溯源及标准化问题。卫生部临床检验中必王冬环等 建立了高效液相色谱串联电喷雾质谱法准确测量糖化血红蛋白的参考方法（不同浓度血 样及国际标准物质批内变异系数CV平均为0. 70 %，总CV为0. 85 %，测定国际标准物质，测 定值与认定值的偏差为-0. 8%~0. 25%，并研制了基于质谱方法的糖化血红蛋白国家一 级标准物质（GBW09181、GBW09182、GBW09183)，送为HbAi。的准确测量和量值溯源提供了有 力的物质保障。
【发明内容】
[0015] 本发明的目的是提供一种同位素稀释液相色谱串联质谱法在检测糖化血红蛋白 中的应用，W及具体的利用同位素稀释液相色谱串联质谱法检测待测样品中糖化血红蛋白 含量的方法。
[0016] 本发明所提供的利用同位素稀释液相色谱串联质谱法检测待测样品中糖化血红 蛋白含量的方法，是在国际临床化学组织（IFCC)推荐的检测方法（参见"ApprovedIFCC referencemethodforthemeasurementofHbAlcinhuma