用于检测幽门螺杆菌感染的方法
【专利说明】用于检测幽口螺杆菌感染的方法
[0001 ] 本发明设及用于检测螺杆菌化elicobacter)感染并且更特别地用于检测幽口螺 杆菌化.pylori)感染的方法，免疫应答作为生物标志物的用途，螺杆菌蛋白质作为生物标 志物的用途，编码螺杆菌蛋白质的核酸作为生物标志物的用途，W及用于在检测螺杆菌感 染并且更特别地用于检测幽口螺杆菌感染之方法中使用的试剂盒。
[0002] 幽口螺杆菌化elicobacter p^ori，H.pylori)，是一种微需氧的革兰氏阴性螺旋 菌，其定居在约一半世界人口中并且被认为是人特有的胃部病原体(Michetti等，1999)。大 多数感染个体患有无症状的慢性胃炎。然而，在一些对象中，感染引起慢性胃炎、消化性溃 瘍形成和萎缩，并且在粘膜相关淋己组织(mucosa-associated lymphoid tissue,MALT)淋 己瘤、胃腺癌和原发性胃非霍奇金氏淋己瘤的形成中发挥着重要作用(Suganuma等，2001)。
[0003] 世界卫生组织将幽口螺杆菌归类为I类致癌原(Goto等，1999)，并且已在动物模型 中证明了致癌作用的直接证据化onda等，1998; T. Wa化nabe等，1998)。根除幽口螺杆菌可W 预防人类的胃癌化emura等，2001)。在高胃癌风险的群体中考虑了测试&治疗策略(Yamaoka 等，1998)。然而，运些方法因缺少有效且可负担的筛选系统(尤其是对于社会经济地位较低 的国家)而受到阻碍。在运些国家中，仅血清学测试可应用，其中大多数具有不良的性能或 者没有经过很好的验证。对于幽口螺杆菌血清学，已知且描述了数种特异性单一标志物。运 些因素已被应用于多种诊断方法，但是其几乎所有都具有很大的限制使得其不适用于幽口 螺杆菌诊断。例如，细胞毒素相关蛋白（cytotoxin-associated p;rotein，CagA)是表征非常 良好的幽口螺杆菌蛋白质。其在cag-PAI(细胞毒素相关基因毒力岛）上进行编码并且被描 述为致癌蛋白质(Franco等，2005;Mura1:a-Kamiya等，2007)。运种蛋白质也是高免疫原性抗 原，使得其可成为血清学测试经常采用的标志物。CagA阳性可W被用作幽口螺杆菌毒力的 指示物，原因是感染CagA阳性菌株的个体处于发生胃与十二指肠疾病的较高风险下。然而， 其不适于用作单一标志物，原因是仅幽口螺杆菌菌株的亚组为化gA阳性。而且，CagA阳性不 是活性感染的特点，原因是根除了幽口螺杆菌的患者多年维持着针对化gA的抗体(Fusconi 等，1999)。因此，其在血清学测试中应一直与其他适当的抗原组合W确定阳性。另一种表征 良好的幽口螺杆菌蛋白质是空泡细胞毒素(vacuolating巧totoxin，VacA)。报道称，其引 起暴露于幽口螺旋杆菌上清液或经纯化蛋白质的细胞中的空泡形成（Cover&Blaser， 1992) nvacA基因编码140W)a的原毒素，其中氨基端信号序列和簇基端片段在分泌期间被蛋 白质水解切割，从而产生了分子质量为88kDa的活性蛋白质，所述活性蛋白质聚集成六聚体 并形成孔（Montecucco&de Be;rnard，2003)。该蛋白质由两个不同的区域组成。信号序列 (sla、slb、s2)和中间区域(ml、m2)，二者均具有似乎调控细胞毒性活性的高等位基因变化 (Athedon等，1995)。化cA的高多样性使得该蛋白质不适用于血清学测试。
[0004] 另一种表征很好的幽口螺杆菌蛋白质Gro化属于分子伴侣家族，其是许多蛋白质 在应力条件下进行适当折叠所需的(Dunn等，1992)。在不同的研究中，表明该蛋白质在不同 的幽口螺杆菌菌株中是高度保守的，并且其血清阳性甚至高于感染患者中对于化gA的血清 阳性(Macchia等，1993 ; Suerbaum等，1994)。另外，在由本发明人进行的研究中，观察到 Gro化的阳性血清状态在德国胃癌患者中比在匹配对照中更为常见(数据未公开）。另外，表 明针对GroEL的抗体在幽口螺杆菌感染的疾病相关损失之后持续得更久。因此，Gro化可为 适用于现症感染或既往感染的标志物，并且可有助于克服由于感染清除而低估幽口螺杆菌 相关胃癌风险的问题(Gao等，2009)。
[0005] 因此，本发明所基于的问题是提供具有高敏感性和/或高特异性的用于检测幽口 螺杆菌感染的方法。本发明所基于的另一个问题是提供运样的测定:与现有技术的测定相 比，其产生较少假阳性和较少假阴性结果，特别是在基于群体的方法中。本发明所基于的又 一个问题是提供用于分别用于执行所述方法和所述测定的手段。本发明所基于的再一个问 题是提供用于幽口螺杆菌感染患者的生物标志物，其中特别地，所述生物标志物优选地显 示出与其他细菌和任何蛋白质、肤或编码所述蛋白质和肤的核酸分子没有任何交叉反应 性。
[0006] 本发明所基于的运些和其他问题通过所附独立权利要求的主题来解决。一些优选 的实施方案可由所附从属权利要求获得。
[0007] 本发明所基于的运些和其他问题还通过W下实施方案来解决。
[0008] 实施方案1:用于在对象中检测螺杆菌感染并且更优选地幽口螺杆菌感染的方法， 其中所述方法包括在来自所述对象的样品中检测针对FliD的免疫应答。
[0009] 实施方案2:实施方案1所述的方法，其中如果在来自所述对象的样品中检测到针 对F1 iD的免疫应答，则所述对象正患有螺杆菌感染，优选幽口螺杆菌感染，或者所述对象过 去已经经历过螺杆菌感染，优选幽口螺杆菌感染。
[0010] 实施方案3:实施方案1至2中任一个所述的方法，其中如果在来自所述对象的样品 中检测不到针对FliD的免疫应答，则所述对象未患螺杆菌感染，优选幽口螺杆菌感染。
[0011] 实施方案4:实施方案1至2中任一个所述的方法，其中如果在来自对象的样品中检 测不到针对FliD的免疫应答，则所述对象过去已经经历过螺杆菌感染，优选幽口螺杆菌感 染。
[0012] 实施方案5:实施方案1至4中任一个所述的方法，其中所述针对FliD的免疫应答是 针对F1 iD的抗体应答，优选抗F1 iD抗体应答。
[0013] 实施方案6:实施方案5所述的方法，其中所述针对FliD的免疫应答是针对FliD的 抗体应答，并且其中所述针对FliD的抗体应答包含选自包括IgG抗体和IgA抗体之组中的至 少一种抗FliD抗体。
[0014] 实施方案7:实施方案5所述的方法，其中所述针对FliD的免疫应答是抗FliD抗体 应答，并且其中所述抗FliD抗体应答包含选自包括IgG抗体和IgA抗体之组中的至少一种抗 FliD抗体。
[0015] 实施方案8:实施方案1至7中任一个所述的方法，其中所述对象感染有表达FliD的 螺杆菌，优选幽口螺杆菌。
[0016] 实施方案9:实施方案1至8中任一个所述的方法，其中所述对象不同于免疫抑制的 对象，优选地，所述对象不同于进行免疫抑制治疗的对象。
[0017] 实施方案10:实施方案1至9中任一个所述的方法，其中所述方法还包括检测螺杆 菌(优选幽口螺杆菌)的一种或更多种抗原。
[0018] 实施方案11:实施方案10所述的方法，其中螺杆菌(优选幽口螺杆菌）的一种或更 多种抗原选自包括化gA、化cA、Gro化、化0231、扣P 0940和化rA的组。
[0019] 实施方案12:实施方案1至11中任一个所述的方法，其中所述方法包括使所述样品 与FliD或其片段反应。
[0020] 实施方案13:实施方案13所述的方法，其中所述方法包括使所述样品与全长FliD 反应。
[0021] 实施方案14:实施方案12至13中任一个所述的方法，其中所述针对FliD的免疫应 答包含能够与FliD相互作用的体液化合物和能够与FliD相互作用的细胞化合物中的至少 一种，其中至少一种体液化合物和/或细胞化合物与FliD相互作用，优选地至少一种与FliD 相互作用的体液化合物和/或细胞化合物与FliD形成相互作用产物。
[0022] 实施方案15:实施方案14所述的方法，其中所述针对FliD的免疫应答是针对FliD 的抗体应答并且其中所述针对FliD的抗体应答与FliD形成相互作用产物。
[0023] 实施方案16:实施方案14所述的方法，其中所述针对FliD的免疫应答是抗FliD抗 体应答并且所述抗F1 iD应答与F1 iD形成相互作用产物。
[0024] 实施方案17:实施方案14所述的方法，其中所述针对FliD的免疫应答包含至少一 种抗F1 iD抗体并且所述抗F1 iD抗体与F1 iD形成相互作用产物。
[0025] 实施方案18:实施方案14至17中任一个所述的方法，其中检测所述相互作用产物。
[0026] 实施方案19:实施方案18所述的方法，其中直接检测所述相互作用产物。
[0027] 实施方案20:实施方案18所述的方法，其中间接检测所述相互作用产物。
[00%]实施方案21:实施方案1至20中任一个所述的方法，其中所述检测通过化ISA或线 免疫测定进行。
[0029] 实施方案22:实施方案1至20中任一个所述的方法，其中所述检测通过侧向流测定 (lateral flow assay)进行。
[0030] 实施方案23:实施方案1至22中任一个所述的方法，其中所述样品选自包括血清、 血浆和全血的组。
[0031] 实施方案24:实施方案1至23中任一个所述的方法，其中所述对象是人类并且螺杆 菌感染是幽口螺杆菌感染。
[0032] 实施方案25:实施方案24所述的方法，其中与所述样品反应的FliD是来自幽口螺 杆菌的FliD。
[0033] 实施方案26:实施方案25所述的方法，其中所述FliD包含根据SEQ ID NO: 1的氨基 酸序列。
[0034] 实施方案27:实施方案1至23中任一个所述的方法，其中所述对象是猪并且螺杆菌 感染是猪螺杆菌化elicobacter suis)感染。
[0035] 实施方案28:实施方案27所述的方法，其中与所述样品反应的F1 iD是来自猪螺杆 菌化.suis)的 FliD。
[0036] 实施方案29:实施方案28所述的方法，其中所述FliD包含根据SEQ ID N0:3的氨基 酸序列。
[0037] 实施方案30:实施方案1至23中任一个所述的方法，其中所述对象是猫并且螺杆菌 感染是猫螺杆菌化elicobacter felis)感染。优选地，猫选自包括家猫、野猫、小型猫科动 物和大型猫科动物的组。
[0038] 实施方案31:实施方案30所述的方法，其中与所述样品反应的FliD是来自猫螺杆 菌化.felis)的 FliD。
[0039] 实施方案32:实施方案31所述的方法，其中所述FliD包含根据SEQ ID N0:5的氨基 酸序列。
[0040] 实施方案33:实施方案1至32中任一个所述的方法，其中用于在人中检测螺杆菌感 染(优选幽口螺杆菌感染)之方法的敏感性大于90 %和/或97 %或W下。
[0041] 实施方案34:实施方案1至33中任一个所述的方法，其中用于在人中检测螺杆菌感 染(优选幽口螺杆菌感染)之方法的特异性大于90 %和/或99 %或W下。
[0042] 实施方案35:对象中针对FliD的免疫应答作为生物标志物的用途。
[0043] 实施方案36:实施方案35所述的用途，其中所述生物标志物是所述对象感染螺杆 菌的生物标志物。
[0044] 实施方案37:实施方案35至36中任一个所述的用途，其中所述生物标志物是所述 对象感染螺杆菌的生物标志物，其中所述对象是人并且螺杆菌是幽口螺杆菌。
[0045] 实施方案38:实施方案35至36中任一个所述的用途，其中所述生物标志物是所述 对象感染螺杆菌的生物标志物，其中所述对象是猪并且螺杆菌是猪螺杆菌。
[0046] 实施方案39:实施方案35至36中任一个所述的用途，其中所述生物标志物是所述 对象感染螺杆菌的生物标志物，其中所述对象是猫并且螺杆菌是猫螺杆菌。
[0047] 实施方案40:根据实施方案35至39中任一个所述的用途，其中所述生物标志物是 预测性生物标志物。
[0048] 实施方案41:根据实施方案35至40中任一个所述的用途，其中所述免疫应答是针 对FliD的抗体应答。
[0049] 实施方案42:根据实施方案35至41中任一个所述的用途，其中所述免疫应答是针 对FliD的抗FliD抗体应答。
[0050] 实施方案43:试剂盒，其包含FliD或其片段和至少一种另外的构成要素。
[0051] 实施方案44:实施方案43所述的试剂盒，其中所述至少一种另外的构成要素选自 包括缓冲剂、固相和说明书散页（leaflet)的组。
[0052] 实施方案45:实施方案43至44中任一个所述的试剂盒，其中FliD是全长FliD。
[0053] 实施方案46:根据实施方案43至44中任一个所述的试剂盒，其中FliD包含氨基酸 序列并且其中所述氨基酸序列选自包括W下的组:根据SEQ ID NO: 1的氨基酸序列、根据 SEQ ID NO:3的氨基酸序列和根据SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
[0054] 实施方案47:根据实施方案43至46中任一个所述的试剂盒，其中所述试剂盒适用 于用来在对象中检测螺杆菌感染的方法或者在用于在对象中检测螺杆菌感染的方法中使 用。
[0055] 实施方案48:根据实施方案47所述的试剂盒，其中所述试剂盒适用于实施方案1至 34中任一个所述的方法或者在实施方案1至34中任一个所述的方法中使用。
[0056] 实施方案49:用于在对象中检测螺杆菌感染并且更优选幽口螺杆菌感染的方法， 其中所述方法包括在来自所述对象的样品中检测FliD。
[0057] 实施方案50:实施方案49所述的方法，其中如果在来自所述对象的样品中检测到 F1 iD，则所述对象正患有螺杆菌感染，优选幽口螺杆菌感染，或者所述对象过去已经经历过 螺杆菌感染，优选幽口螺杆菌感染。
[0058] 实施方案51:实施方案49至50中任一个所述的方法，其中如果在来自所述对象的 样品中检测不到FliD，则所述对象未患螺杆菌感染，优选幽口螺杆菌感染。
[0059] 实施方案52:实施方案49至51中任一个所述的方法，其中如果在来自所述对象的 样品中检测不到FliD，则所述对象过去已经经历过螺杆菌感染，优选幽口螺杆菌感染。
[0060] 实施方案53:实施方案49至52中任一个所述的方法，其中所述对象感染表达F1 iD 的螺杆菌，优选幽口螺杆菌。
[0061] 实施方案54:实施方案49至53中任一个所述的方法，其中所述方法还包括检测螺 杆菌(优选幽口螺杆菌)的一种或更多种抗原。
[0062] 实施方案55:实施方案54所述的方法，其中螺杆菌(优选幽口螺杆菌）的一种或更 多种抗原选自包括化gA、化cA、Gro化、化0231、扣P 0940和化rA的组。
[0063] 实施方案56:实施方案49至55中任一个所述的方法，其中FliD是全长FliD或其片 段。
[0064] 实施方案57:实施方案49至56中任一个所述的方法，其中所述方法包括使所述样 品与相互作用剂反应，其中所述相互作用剂与FliD或其片段相互作用，优选地所述相互作 用剂与FliD或其片段特异性相互作用。
[0065] 实施方案58:实施方案57所述的方法，其中所述相互作用剂与全长FliD或FliD的 片段相互作用。
[0066] 实施方案59:实施方案57至58中任一个所述的方法，其中所述相互作用剂选自包 括抗体、适配体和spiegelmer的组。
[0067] 实施方案60:实施方案59所述的方法，其中所述相互作用剂是抗体，其中所述抗体 是单克隆抗体或多克隆抗体。
[0068] 实施方案61:实施方案56至60中任一个所述的方法，其中所述相互作用剂与所述 对象中存在的F1 iD形成相互作用产物。
[0069] 实施方案62:实施方案61所述的方法，其中检测所述相互作用产物。
[0070] 实施方案63:实施方案62所述的方法，其中直接检测所述相互作用产物。
[0071] 实施方案64:实施方案62所述的方法，其中间接检测所述相互作用产物。
[0072] 实施方案65:实施方案49至64中任一个所述的方法，其中所述检测通过ELISA或线 免疫测定进行。
[0073] 实施方案66:实施方案49至63中