分离剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及色谱用的分离剂，特别是涉及用于亲水性物质的分离的亲水相互作用 液相色谱用的分离剂。
【背景技术】
[0002] 高效液相色谱(HPLC)是在生命科学、医药学等各种领域得到应用的分析方法之 一，近年来特别是在高度的分离或高速领域要求高性能化。HPLC有各种分离模式，作为在目 前的HPLC分析中广泛利用的模式，可举出反相色谱(RPLC)。但是，在生命科学领域中重要的 生理活性物质、代谢物等为高极性且亲水性的化合物多，在RPLC中这些亲水性化合物的保 留变小，因此分离变难。为了分离这样的化合物而设计的是亲水相互作用液相色谱 (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography ,HILIC)(非专利文南犬2) 〇虽然HILIC 可归类于正相液相色谱(NPLC)，但由于在流动相中使用有机溶剂与水或缓冲液的混合溶 剂，所以不同于一般的NPLC。在一般的NPLC中，由于在流动相中使用非水溶性溶剂，所以难 以溶解亲水性的化合物。但是，在HILIC中，由于利用水系的流动相，所以适合于在正相条件 下不洗脱的亲水性化合物的分离。
[0003] 在专利文献1中，记载了使用硅胶作为载体，并在该载体上结合了来源于丙烯酰胺 的结构作为配体的分离剂。
[0004] 在专利文献2中，记载了负载有将乙烯基四唑聚合而得到的聚合物的分离剂。
[0005] 另外，在非专利文献1中，作为亲水相互作用色谱用的分离剂，记载了用四唑进行 修饰的腈改性二氧化硅。
[0006] 现有技术文献 专利文献 专利文献1:日本特许第2504005号公报 专利文献2:中国专利第101837284号说明书 非专利文献 非专利文献I:Chromatographia, 73，865-870 (2011) 非专利文献2:J. Chromatography. A, m8，592〇_5938 (2〇11)〇
【发明内容】
[0007] 发明所要解决的课题 专利文献1和2、非专利文献1所记载的分离剂的亲水性不高，有改善的余地。本发明提 供一种亲水相互作用色谱用的新分离剂。
[0008] 解决课题的手段 本发明人着眼于来源于如四唑那样的以式(I)表示的化合物的构成单元的离子相互作 用或氢键。
[0009] 于是，合成具有这样的构成单元的（甲基)丙烯酸单体，发现负载有将该（甲基)丙 烯酸单体聚合而得到的配体的分离剂，与市售的以往的亲水相互作用色谱用的分离剂相 比，对特定化合物的保留特性优异，从而完成以下所示的本发明。
[0010] [1]-种分离剂，所述分离剂是由载体和在载体上负载的配体形成的亲水相互作 用色谱分离剂，其中，该配体为具有来源于以下列式(I)表示的化合物的构成单元的（甲基） 丙烯酸聚合物。
在式（I)中，在构成杂环的原子间具有1或2个双键，X1选自S、SCH3+、0、NH、NCH 3、CH2、CHR 和CR1R2，X2、X3和 X4分别选自 N、NH、NCH3、CH2、CHR、NCH3+、CH、CR、CR1R 2，其中 Ri和R2分别为取代 或未取代的碳原子数1~18的烷基、碳原子数6~18的芳基、碳原子数2~18的烯基、碳原子数2~ 18的炔基、碳原子数7~18的芳烷基、碳原子数2~18的酰基、碳原子数3~18的环烷基、羧基、氨 基、碳原子数6~18的芳氧基或碳原子数1~18的烷氧基、卤素、羟基、硝基和氰基中的任一种， 其中R为取代或未取代的碳原子数1~18的烷基、碳原子数6~18的芳基、碳原子数2~18的烯 基、碳原子数2~18的炔基、碳原子数7~18的芳烷基、碳原子数2~18的酰基、碳原子数3~18的 环烷基、羧基、氨基、碳原子数6~18的芳氧基或碳原子数1~18的烷氧基、卤素、羟基、硝基和 氰基中的任一种，Xi、X 2、X3和X4中的至少2个不为CH2、CH、CR、CR 1R2，R3为H或CH3。）
[2][1]所记载的分离剂，其中，上述配体为具有来源于选自氨基咪唑、氨基咪唑啉、氨 基噻唑、氨基三唑、氨基四唑、氨基噻二唑、氨基甲基咪唑的化合物的构成单元的（甲基）丙 烯酸聚合物。
[0012] [3][1]所记载的分离剂，其中，上述配体为具有来源于氨基四唑的构成单元的（甲 基)丙烯酸聚合物。
[0013] [4] [1]所记载的分离剂，其中，上述配体为具有来源于氨基四唑的构成单元的甲 基丙烯酸聚合物。
[0014] [5][1>[4]中任一项所记载的分离剂，其特征在于，上述载体为硅胶或二氧化硅 整体料（silica monolith)。
[0015] 发明的效果 本发明的分离剂是在载体上负载具有来源于以上述式(I)表示的化合物的构成单元的 (甲基)丙烯酸聚合物而形成的。根据本发明，提供对进行特定亲水性化合物的分离有用的 新分离剂。
【附图说明】
[0016] [图1]为示出在实施例中制备的甲基丙烯酰胺单体的1H NMR测定结果的图。
[0017] [图2]为示出用于柱试验的化合物的结构的图。
[0018] [图3]为示出比较填充有本发明的分离剂和市售品的分离剂的柱的k(U)而得到 的结果的图。
[0019] [图4]为示出使用填充有本发明的分离剂和市售品的分离剂的柱的核酸衍生物 等8种亲水性化合物的分离结果(色谱图）的图。
[0020] [图5]为对填充有本发明的分离剂的柱和市售品的柱，示出将log k(U)和log k (TMPAC)标绘而得到的结果的图。
[0021] [图6]为对填充有本发明的分离剂(使用不同的（甲基)丙烯酰胺类单体）的柱和 市售品的柱，示出将a(Tb/Tp)和a(U/2dU)标绘而得到的结果的图。
[0022] [图7]为对填充有本发明的分离剂（以不同的浓度使用5-甲基丙烯酰胺基-IH-四 唑）的柱和市售品的柱，示出将a(Tb/Tp)和a(U/2dU)标绘而得到的结果的图。
[0023][图8]为对本发明的分离剂(整体柱(monolithic column))与市售品和比较对象 的柱，示出将a(Tb/Tp)和a(U/2dU)标绘而得到的结果的图。
[0024] [图9]为示出使用本发明的分离剂(整体柱）与比较对象的柱分离氟尿嘧啶化合 物而得到的色谱图的图。
【具体实施方式】
[0025] 〈本发明的分离剂所负载的配体〉 本发明的分离剂是负载在（甲基)丙烯酸聚合物中含有来源于以式(I)表示的化合物的 构成单元的配体而形成的分离剂。
[0026] 另外，在本发明中所谓的"(甲基)丙烯酸"包含"甲基丙烯酸"和"丙烯酸"这两者。
在式（I)中，在构成杂环的原子间具有1或2个双键，X1选自S、SCH3+、0、NH、NCH 3、CH2、CHR 和CR1R2，X2、X3和 X4分别选自 N、NH、NCH3、CH2、CHR、NCH3+、CH、CR、CR 1R2，其中 RjPR2分别为取代 或未取代的碳原子数1~18的烷基、碳原子数6~18的芳基、碳原子数2~18的烯基、碳原子数2~ 18的炔基、碳原子数7~18的芳烷基、碳原子数2~18的酰基、碳原子数3~18的环烷基、羧基、氨 基、碳原子数6~18的芳氧基或碳原子数1~18的烷氧基、卤素、羟基、硝基和氰基中的任一种， 其中R为取代或未取代的碳原子数1~18的烷基、碳原子数6~18的芳基、碳原子数2~18的烯 基、碳原子数2~18的炔基、碳原子数7~18的芳烷基、碳原子数2~18的酰基、碳原子数3~18的 环烷基、羧基、氨基、碳原子数6~18的芳氧基或碳原子数1~18的烷氧基、卤素、羟基、硝基和 氰基中的任一种，Xi、X2、X 3和X4中的至少2个不为CH2、CH、CR或CR1R 2，R3为H或CH3。
[0028] 在式（I)中，X1、X2、X3和X4分别优选选自S、N、0、NH、NCH 3、CH2，更优选选自S、N和NH。
[0029] 由于在作为配体的（甲基)丙烯酸聚合物中含有来源于以式(I)表示的化合物的构 成单元，所以通过来源于式（I)的构成单元的离子相互作用或氢键的作用，对分离剂保留亲 水性化合物的能力造成影响。
[0030] 特别是在使用杂环中具有氮原子的化合物作为以式（I)表示的化合物的情况下， 该氮原子作为氢键受体起作用，这对亲水性化合物的保留造成影响。
[0031] 在上述化合物中，就（甲基)丙烯酰胺基四唑来看，则为在环上含有4个氮原子的化 合物，是通过脱质子化而共振稳定化的酸性化合物。此外，四唑上的氮原子作为氢键的受体 起作用。
[0032] 以式（I)表示的化合物也可使用市售的化合物，还可使用公知的方法进行合成。
[0033] 以式（I)表示的化合物例如可通过使以下的以式（II)表示的化合物与（甲基)丙烯 酰氯在例如四氢呋喃那样的溶剂中反应，从而得到具有以式（I)表示的结构的（甲基)丙烯 酰胺单体。需说明的是，（甲基)丙烯酰氯指甲基丙烯酰氯或丙烯酰氯。
(在式(II)中，在构成杂环的元素间具有1或2个双键，XrX4表示与式(I)相同的基团，R3 表示氢或甲基。） 作为以式(II)表示的化合物的具体实例，例如可列举出以下化合物。
[0035] 可列举出如5-氨基四唑那样的氨基四唑，如2-氨基咪唑那样的氨基咪唑，如2-氨 基-2-咪唑啉那样的氨基咪唑啉，如2-氨基噻唑那样的氨基噻唑，如3-氨基-1，2，4-三唑、4_ 氨基-1，2，4_三唑那样的氨基三唑，如2-氨基-1，3，4_噻二唑那样的氨基噻二唑和如2-氨 基-1-甲基-IH-咪唑那样的氨基甲基咪唑。
[0036] 由于上述式（I)的（甲基)丙烯