激光泵浦时间分辨上转换发光活体成像系统的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于荧光成像技术领域，具体涉及一种激光栗浦时间分辨上转换发光活体成像系统。
【背景技术】
[0002]荧光成像作为一种新兴的生物成像技术，由于其造价相对低廉、成像速度快、灵敏度高、侵入性低等优势。另外，不同于临床上的成像方式如，X射线计算机断层扫描、核磁共振成像、单光子计算机断层扫描等成像方式，荧光成像可以使被检测的生物体免受放射损伤的问题。因此，荧光成像技术在生物医学领域有着广阔的应用前景。荧光成像的实现是基于具有光致发光性质的材料在外界光源激发下产生荧光发射，通过检测荧光发射信号的强度、位置、发射波长等性质，来研究生物体的特定生理过程。在荧光成像中使用的光致发光性质的材料通常被称为荧光探针，目前研究的比较广泛的荧光探针有，小分子荧光探针、量子点、上转换荧光探针等，其中上转换荧光探针有别于其他的荧光探针，在长波长的外界光源激发下可以发射短波长的荧光，这种独特的发光性质使得上转换荧光探针在进行荧光成像时，可以大大避免生物组织的自发荧光干扰，而且上转换荧光探针的光稳定性也很高，不容易发生荧光淬灭等问题，适用于生物体的长期荧光成像观测。但是，目前的上转换荧光探针的发光效率还比较有限，不如小分子荧光探针等的荧光量子产率高，所以在成像时使用的激发光的强度较高，由此会造成成像时激发光的不完全滤除使得成像信号受到干扰，这种干扰将使得荧光信号和激光信号变得难以区分。如果能够解决荧光成像中的激发光干扰的问题，将大大提高荧光成像的正确率以及分辨率，这将为荧光成像在临床医学上的实际应用做出重大的贡献。
[0003]由于上转换发光材料的发光寿命较长(10-1000ys)，相比于小分子荧光探针的寿命要大四到五个数量级。因此上转换发光探针在激发光照射之后又相当长时间的延迟发光效应，这为在荧光成像中取出激发光干扰提供了十分有利的条件。如果可以控制激发光以较短的脉冲形式激发上转换荧光探针，并且选择性只接收延迟荧光的时间区段，就可以完全滤除激发光的信号。满足这一性能的技术被称为时间分辨荧光技术，该技术是近十年来发展起来的新技术，通常使用脉冲光激发荧光探针产生滞后的脉冲式响应，再通过分时段采集响应的荧光信号来从原理上彻底滤除激发光。目前时间分辨荧光技术已经应用在了荧光光谱检测以及荧光共聚焦显微镜上，但是在小动物活体荧光成像系统上的应用实施几乎没有，所以时间分辨技术如果能与上转换荧光活体成像技术结合起来，发展一种新型的时间分辨上转换发光活体成像系统，将有望解决制约荧光成像技术进入临床应用的瓶颈问题，为生命科学和医学研究提供一种有力的工具。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种激光栗浦时间分辨上转换荧光成像系统，该系统能够利用上转换发光材料长发光寿命的特点，通过短脉冲光激发上转换发光材料后，收集没有激发光存在的延迟荧光时间区段，实现对标记有上转换发光探针的材料、细胞或者生物组织的实时、非侵入式的高信噪比、高灵敏度成像。
[0005]本发明提出的激光栗浦时间分辨上转换荧光成像系统，其结构如图1所示，由半导体激光器1、脉冲控制器2、光学斩波器3、(XD检测器4、光学镜头5、样品台6和计算机7组成；其中，半导体激光器I带有TTL调制功能，作为时间分辨成像荧光激发源，其出射光对准样品台6;样品台6用于放置上转换荧光探针材料以及上转换荧光探针材料标记的细胞、活体动物以及组织，样品台6对准光学镜头5;光学镜头5对准光学斩波器3，且光学镜头5的光学焦点与光学斩波器3处于同一个平面;光学斩波器3对准CCD检测器4;半导体激光器I以及光学斩波器3与脉冲控制器2连接，CCD检测器4通过信号接收线路连接计算机7;计算机7用于显示得到荧光成像的照片。
[0006]本成像系统中，脉冲控制器2—方面作为时间分辨成像的半导体激光器I开启与关闭控制器，用于控制半导体激光器I开启与关闭；另一方面作为光学斩波器3的转速感应器，用于控制光学斩波器3的转速。
[0007]本成像系统中，光学斩波器3作为延迟荧光收集时间区段的控制器，用于控制延迟荧光收集时间区段。
[0008]本成像系统中，半导体激光器I可采用中心波长为980 nm、808 nm、730 nm、1064nm、1532 nm的半导体激光器。
[0009]本成像系统能够发射脉冲激发光，通过对激发光脉冲的调制以及光学斩波器的控制，选择性的只收集没有激发光存在的延迟荧光的时间区间来完全避免激发光对上转换荧光信号的干扰，实现对标记有上转换荧光探针的材料、细胞和活体动物和组织进行实时高灵敏度以及高信噪比的成像。
[0010]本成像系统的工作过程是:在脉冲控制器2的控制下，带有TTL调制的半导体激光器I产生脉冲激光束并照射在样品台6上，样品台6上承载的标记有上转换荧光探针的材料、细胞或者活体动物以及组织反射了一部分激光，这部分被反射的激光通过光学镜头5汇聚之后进入光学斩波器3，由于脉冲控制器2的调谐，被反射的激光被光学斩波器3的挡片阻挡而没有进入CCD检测器4。与此同时，照射在样品上的脉冲激光还激发了样品产生了滞后的上转换荧光响应，这部分上转换荧光通过光学镜头5并经过汇聚进入光学斩波器3，由于脉冲控制器2的调谐，没有激发光存在的上转换荧光的区段通过光学斩波器3的狭缝而进入CXD检测器4，(XD检测器4接收的荧光信号通过计算机7进行显示得到荧光成像的照片。
[0011 ]与现有技术相比，本成像系统具有以下优点:
1.首次实现了时间分辨技术与上转换活体荧光成像技术的结合，为活体荧光成像技术提供了一种新的模式。
[0012]2.可以实现活体荧光成像中的激发光与荧光的完全分离，避免激发光在荧光成像中的干扰，大大提高成像的准确度以及灵敏度。
[0013]3.可以实现激发光波长