一种基于elisa检测dna-蛋白交联体的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及一种与诊断相关的基于ELISA方法检测在某些理化因素作用下，直接或间接产生的DNA-蛋白交联物的试剂盒。
【背景技术】
[0002]生物机体中，DNA-蛋白的相互作用，如DNA聚合酶、RNA聚合酶、转录因子、DNA损伤修复蛋白等与基因组DNA非共价结合的相互作用(non-covalent interact1n)，在细胞增殖和维持遗传基因的完整性等方面发挥了重要作用。然而，药/毒物暴露下形成的共价结合(Covalent interact1n)的交联型 DNA-蛋白复合体(DNA-Protein crosslinkingcomplex，DPC)，由于阻碍了DNA的复制和转录，是一种严重的DNA损伤方式。甲醛，辐射，氮芥，顺铂等都可以引起DPC生成，并引起细胞增殖旺盛的组织，如骨髓、肿瘤等的药物敏感性增加(Wong VC,Cash HL,Morse JL,Lu S,Zhitkovich A: S-phase sensing of DNA-protein crosslinks triggers TopBP1-1ndependent ATR activat1n and p53_mediated cell death by formaldehyde.CelI Cycle 2012,11:2526-37.1de H，Shoulkamy MI,Nakano T,Miyamoto-Matsubara MjSalem AM:Repair and b1chemicaleffects of DNA-protein crosslinks.Mutat Res 2011，711:113-22.) dDPC致细胞损伤和基因突变的毒性效应已经得到确证(Nakano TjOuchi RjKawazoe JjPack SPjMakino K，Ide H:T7RNA polymerases backed up by covalently trapped proteins catalyzehighly error prone transcript1n.J B1l Chem 2012，287:6562-72.Nakano T，Mitsusada YjSalem AM,Shoulkamy MI,Sugimoto TjHirayama RjUzawa AjFurusawa Y，Ide H:1nduct1n of DNA-protein cross-links by 1nizing radiat1n and theireliminat1n from the genome.Mutat Res 2015，771:45—50.Nakano T,Miyamoto-Matsubara MjShoulkamy MI,Salem AMjPack SPjIshimi YjIde H:Translocat1n andstability of replicative DNA helicases upon encountering DNA-protein cross-links.J B1l Chem 2013,288:4649-58.)，近年来在DPC损伤修复机制上也有一些突破性的进展，如最近《Cell》发表文章，证实DPC可以通过复制依赖的水解酶修复(Duxin JPjDewar JM,Yardimci H,Wal ter JC: Repair of a DNA-protein crosslink byreplicat1n-coupled proteolysis.Cell 2014，159:346—57.Stingele JjSchwarz MS,Bloemeke NjWolf PGjJentsch S:A DNA-dependent protease involved in DNA-proteincrosslink repair.Cell 2014，158:327-38.)。但总的说来，DPC在作用机制尚有诸多不明之处。较其它的DNA损伤方式，如核酸碱基上加合烷化物、联间/内交联形成等，DPC引起的细胞损伤，突变效应更严重，修复更加困难。检测细胞或组织样本中总DPC(Total DPCJ-DPC)水平对于研究DPC的形成及细胞损伤修复机制，临床评估药物敏感性等有重要意义。
[0003]06-甲基转移酶(06_me thy lguanine-DNA methy I transferase，MGMT)，一种 23kDa的蛋白，与DNA烷化损伤修复密切相关，是目前唯一发现的在哺乳细胞中能够直接移除06位点烃化加合物的修复酶，被认为在维持基因组稳定性和肿瘤形成中极为重要(Pegg AE:Multifaceted roles of alkyItransferase and related proteins in DNA repair,DNAdamage,resistance to chemotherapy，and research tools.Chem Res Toxicol 2011，24:618-39.) eMGMT是一种有限的消耗性酶，补充缓慢。MGMT在临床的肿瘤化疗，药物开发中均有重要作用。有报道，在造血组织高表达外源性MGMT可增加细胞对烷化剂的耐受(Schambach A,Baum C:Vector design for express1n of 06~methylguanine-DNAmethyItransferase in hematopoietic cells.DNA Repair(Amst)2007，6:1187-96.)。这说明MGMT表达水平与细胞的烷化剂耐受密切相关。我们的前期研究发现，在氮芥等双功能烷化剂作用后，MGMT无法发挥移除DNA加合物的正常功能，因为此时MGMT被交联在DNA上形成MGMT-DNA crosslink(M-DPC)无法释放。与其它的DPC损伤一样，M-DPC被证实具有致DNA复制损伤和突变的多重作用。在一些MGMT丰富的组织或细胞中，双功能烷化剂弓I起的M-DPC的增加被认为是动物/细胞毒性反应的重要原因(Kalapila AG1Pegg AE:AlkyItransferase-mediated toxicity of bis—electrophiIes in mammaliancells.Mutat Res 2010,684:35-42.Kisby GE,Olivas A,Park T1ChurchweII M,DoergeD,Samson LD,Gerson SL,Turker MS:DNA repair modulates the vulnerability of thedeveloping brain to alkylating agents.DNA Repair(Amst)2009,8:400-12.)。检测细胞或组织样本中M-DPC水平在此情况下有重要意义。
[0004]虽然自上世纪70年代，人们就发现DPC存在于多种染毒组织、细胞中，但由于相关技术在普通实验室难以开展，针对DPC的检测难以应用，能够形成DPC的药物通常伴有大量的非DPC损伤，欲获得较高纯度的DPC样本通常需要使用超速离心等复杂手段。DPC的检测技术近年来有了进步，实现了以DNA加合物快速回收(RADAR，rapid approach to DNA adductrecovery)一狭缝印迹(slot blotting) (RADAR-SB)的联合检测方法，这也为本项目开发快速检测DPC的ELISA试剂盒奠定了基础。根据我们对文献的调研和分析，DPC检测技术的主要发展历程如下:
[0005]技术I ,SDS-KCl检测法检测T-DPC。这是一种上世纪70-80年代开发的方法，简便易行，但线性范围窄，灵敏度差。其原理为SDS可以和游离蛋白及DPC上交联蛋白结合，而不和DNA结合，样品中加入KCl溶液时DPC和蛋白质沉淀下来，而游离的DNA留在上清液中。向沉淀中加入蛋白酶K除去蛋白质使DPC中的DNA游离出来，用荧光法测定此DNA的含量以及原液中DNA的含量，计算交联DNA和总DNA的比值，进而得出DNA和蛋白质的交联程度。DPC系数=交联DNA/(交联DNA+游离DNA)。
[0006]技术2，超速离心-热裂解法检测特异蛋白交联DPC(Michaelson-Richie ED,Loeber RL,Codreanu SG,Ming X1Liebler DC,Campbell C1Tretyakova NY:DNA-proteincross-linking by 1,2,3,4-diepoxybutane.J Proteome Res 2010，9:4356-67.)。是之前主流的DPC检测方法，该法制备的DPC纯度高，交联蛋白活性保存好，缺点是步骤繁琐，需应用到超速离心机等昂贵设备，一般实验室无法开展。实验原理为DPC通过氯化铯密度梯度超高速(大于100，000g)长时间离心后，胞核成分被分离在不同的层面上，收集纯净的DPC。将DPC加热后使交联有DPC的碱基从DNA上分离下来，便可以进行HPLC-MS或者WesternBlotting，以分析交联蛋白的种类和含量。
[0007]技术3，FITC标记检测T_DPC(ShoulkamyMI ,Nakano T,Ohshima M1Hirayama R,Uzawa A,Furusawa Y,Ide H:Detect1n of DNA-protein crosslinks(DPCs)by noveldirect fluorescence labeling methods: distinct stabilities of aldehyde andradiat1n-1nduced DPCs.Nucleic Acids Res 2012,40: el43.)。Ide，H.等于2012年报道了使用FITC标