一种检测养殖废物中雌激素的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于环境分析技术领域，具体涉及一种检测养殖废物中雌激素的方法。
【背景技术】
[0002]环境激素污染被认为继臭氧层破坏、温室效应之后的第三大全球性重大环境问题。环境激素定义为对生物的正常行为及生殖、发育相关的正常激素的合成、储存、分泌、体内输送、结合及清除等过程产生妨碍作用的物质。环境激素的被认为是导致男性精子数量减少、精子畸形，女性不孕不育现象的主要因素，也和成人类免疫系统功能下降，内分泌异常，恶性肿瘤增多，神经系统出现障碍，新生儿畸形，发育不全等疾病逐年上升密切相关。同时，环境激素能够影响野生动物的内分泌系统、免疫系统和神经系统，从而对生态系统造成威胁。环境激素污染和人类活动密切相关。生活污水和养殖废弃物被认为是环境激素的主要来源。目前最受关注的激素主要是雌激素，包括雌二醇，炔雌醇，雌酮，双酚A等。生活污水和养殖废弃物的排放是它们进入环境的主要途径。
[0003]随着对环境激素危害的认识，建立高效、可靠的分析方法迫在眉睫。环境激素污染的特点是:第一，分布广泛，在各种介质，包括水体、土壤、生物样品中均可能存在；第二，浓度低，通常在ng/L水平，但由于激素自身的特点，即使在这样的低浓度，也能产生显著的生物效应。目前，雌激素的分析主要通过高效液相色谱-串联质谱检测(HPLC/MS/MS)技术，普通液相色谱-紫外检测(HPLC/DAD)的灵敏度难以满足要求。相对于普通的HPLC/DAD的广泛应用，HPLC/MS/MS属于高端精密仪器，成本高，对操作人员的要求也高，一般分析实验室不具备。除此之外，HPLC/MS/MS分析对样品前处理有很高的要求。对于水样，首先要经过固相萃取(SPE)富集，然后要进行复杂的净化处理，才可以进HPLC/MS/MS分析。净化的目的是尽可能去除样品中的各种杂质，否则会对质谱分析产生严重干扰，影响结果准确性。总之，环境激素的定量分析步骤繁琐、耗时，对人员和仪器要求很高，经济成本也很高。
[0004]水中环境激素的分析方法已经相对成熟。养殖废弃物的排放和还田是环境中激素的主要来源之一。相对于水样，养殖废弃物的成分要复杂的多，尤其含有一定量的油脂。雌激素亲水性不强，用水提取回收率很低，因此必须用有机溶剂，但何种溶剂合适，目前还不清楚。此外，有机溶剂在提取激素的过程中，会同时把样品中的油脂提取出来。油脂进入无论对后面的高效液相色谱分离，还是质谱分析，都是致命的。以上种种因素，对于养殖废弃物中的激素物质，目前还没有可靠的提取、分析方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种养殖固体废弃物(如养鸡场、养猪场包括粪便、绒毛、食物残渣等)中雌二醇，炔雌醇，雌酮，双酚A等雌激素的定量分析方法，该方法能够有效克服样品中各种杂质的干扰，同时成本相对低廉，适合大批量样品的分析。
[0006]本发明的目的是通过以下方式实现的:
[0007]—种检测养殖废物中雌激素的方法，其特征在于该方法包括以下步骤:
[0008](I)样品萃取:取养殖场固体废物3-10g，以体积比为2:1-4:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液为溶剂，在超声辅助下萃取，合并萃取液，离心，取上清液，用氮气吹溶剂使之挥发，直至剩余溶液l_2mL ;
[0009](2)样品净化:取硅胶2_5g，用正己烷活化，装入径高比为1:10-15的玻璃柱中，静置，待固体沉降完全，排放正己烷，使其液面和硅胶柱齐平，制备得到净化小柱；玻璃柱径高比优选为I:10 ；
[0010]将步骤(I)得到的样品用正己烷溶解，再上载到净化小柱，用正己烷清洗，然后用氮气将娃胶柱吹干；
[0011](3)样品洗脱:用乙腈洗脱，收集洗脱液，浓缩至l_2ml ;
[0012](4)样品测定:用高效液相色谱-荧光检测器进行定量分析，荧光检测器的激发波长和发射波长分别为280nm和310nm。
[0013]该方法中二氯甲烷和甲醇的混合溶液体的积比优选为2:1。
[0014]上述方法步骤(I)中所述的萃取条件为萃取2-3次，每次萃取5-15分钟。
[0015]上述方法步骤(2)所用的硅胶粒径为过80-100目筛。所述的玻璃柱优选直径1cm，柱长 10_15cm。
[0016]上述方法步骤⑵中样品用10_20mL正己烷溶解，然后上载到净化小柱，另外再用30mL正己烷清洗，然后用氮气将硅胶柱吹干。所用的正己烷的用量为10-20ml，油脂作为非极性物质，很容易被正己烷洗掉，而雌激素有一定极性，基本被硅胶吸附保留。
[0017]上述方法步骤(3)所用的乙腈用量为2_5mL，可将残留在硅胶柱上的雌激素用乙腈洗脱下来。
[0018]上述方法步骤(2)硅胶用正己烷活化的具体步骤是将硅胶中加入正己烷搅拌糊状再倒入玻璃柱。
[0019]由于雌二醇，炔雌醇，雌酮，双酚A等等雌激素分子结构类似，有相近的荧光特性，可以用荧光检测器进行分析，上述方法步骤(4)高效液相色谱-荧光检测器进行分析时采用色谱柱为C18反相柱，流动相为甲醇和水，流速lmL/min，采用梯度洗脱，甲醇初始浓度为30%，在15分钟内升高到50%并保持10分钟，然后再在10分钟内继续升高到100%，并保持5分钟。
[0020]本发明采用样品净化的主要目的是去除其中的油性物质，以避免对后续的仪器分析产生影响，是关键步骤。净化在净化小柱上完成。净化小柱优选为玻璃材质，径高比最好为1:10，下面有活塞可以控制溶剂流出。填充物为80-100目硅胶，硅胶加入正己烷搅拌糊状倒入玻璃柱，静置，待固体沉降，注意硅胶柱中间不能留有气泡。打开下面的活塞，排放正己烷，使其液面和硅胶柱齐平。
[0021]与现有技术比较本发明的有益效果:
[0022](I) 二氯甲烷/甲醇混合溶剂有效提取养殖固体废弃物中的雌激素，回收率在80%以上。
[0023](2)本发明采用硅胶小柱可以有效去除样品中的大量油脂类物质。
[0024](3)运用HPLC/FL分析，相对HPLC/MS/MS，仪器相对便宜、普遍，