大肠癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于蛋白质谱应用技术领域，具体地说，设及一种大肠癌唾液蛋白指纹图 谱分子诊断模型建立方法。
【背景技术】
[0002] 结直肠癌(CRC)是世界范围内男性和女性第Ξ个常见的癌症，是胃肠道常见的恶 性肿瘤，W41-65岁发病率最高。肠癌如果早期发现5年生存率可达90%，而有转移的进展期 大肠癌其5年生存率低于10%。
[0003] 内窥镜检查仍然是大肠癌诊断的金标准，虽然内镜设备得到了一次次升级变革， 从传统的全结肠电子内镜到放大内镜及染色内镜、窄带内镜(NBI)、自发巧光内镜(AFE)、共 聚焦激光显微内镜(CEM)、超声内镜化US)、结肠胶囊内镜(CCE)等各项先进技术在内镜中的 应用，提高了分辨率，但仍然价格昂贵而又对人体伤害较大，运严重限制了大肠癌的早期诊 断。而新近发展起来的大肠癌肿瘤标志物检测，单项指标检测准确率低，多项指标联合检验 虽可一定程度上提高检测的准确性，但结果的准确性（<70% )仍不能满足临床诊断肠癌需 要，且血液检测亦为有创检测。目前为止还没有一个快速、准确而又适合于大规模筛查的大 肠癌早期诊断方法，因此，寻求一个简便、快速、准确率高的无创伤检查新方法势在必行。
[0004] 随着质谱仪的发展和蛋白质组学研究的而深入，产生了蛋白质指纹图谱的诊断新 技术，该技术是通过质谱分析不同疾病血清中有许多潜在的生物标志物，通过质谱定量和 定性分析运些生物标志物可用于疾病的诊断。该方法已经成功的用于研究SARS、癌症等诊 断标志物。
[0005] 目前蛋白指纹图谱技术在肠癌的研究主要有:大肠癌(CRC)与正常人的鉴别诊断、 大肠癌无转移(CRC)与大肠癌肝转移（同时性肝转移(SLM)/异时性肝转移(MLM))的鉴别、大 肠良性病变与大肠癌鉴别，W及大肠癌预后模型等。采用蛋白质组学技术进行大肠癌研究， 各研究者均得到敏感性、特异性、准确性较高的分子诊断模型，然而，各研究者所筛选得到 的差异蛋白质峰差异很大^3(：与正常对照组的差异蛋白对比研究，柳俊刚等发现1/^2为 3223.43、7971.57、11493.00;崔丹瑜等发现1/2为5909、5：341、2685、2811、3928、6635、8933; 林建军等发现 M/Z 为 2870.7、3084.0、9180.5、13748.8;张巍等发现为 2974、3282、5948、 2957、2982、5920、6647、6661;Liao CC等发现 1800-16000Da范围内的73个峰;Xu W发现 15个 差异蛋白（2900-9000Da);周智勇等发现26个下调蛋白、52个上调蛋白，范围在40000曰- 11100曰。〔1?(：无转移与〔1?(：肝转移的差异蛋白对比研究，柳俊刚等发现1/2为3223.43、 3511.88、8894.49;崔丹瑜等发现在肝转移组1/2为7570、7795、7939、8137、8925、9196、 11814、7837低表达，而M/Z为5813蛋白点高表达。肠良性病变与CRC差异蛋白对比研究，Xu W 等发现M/Z为3570、3101、4869在腺瘤组高表达，在CRC组低表达；张巍等发现M/Z为3016、 66172个蛋白点在两组比较中差异显著。李小琼等对正常组、良性病变组W及CRC(术前)组 Ξ者的差异蛋白研究发现7个差异点，M/Z分别为4955、5325、5890、6615、7739、8109、8575, 于新哲等发现，结直肠癌无转移(CRC)对比结直肠癌异时性肝转移组(MLM)，得到0个差异蛋 白峰，无统计学差异(P〉〇.〇5);MLM对比SLM，得到1个差异蛋白峰，M/Z = 4355.26(P<0.05); 由此可见，实验可重复性不足，可能与实验中样品的预处理方法（忍片的种类、厂家、批号 等）、试验操作者技能水平、研究者所采取的质谱方法(MALDI、SELDI或其他）、数据分析方法 (SVM、留一法等)等不一致有关。
[0006] 现有研究多针对肠癌患者血液标本或者组织标本的有创检测，受试者依从性差， 不利于反复采样、实时动态监测W及人群盲筛推广，具有一定的限制性，不能广泛应用。
[0007] 因此，提供一种诊断模型简便、快速、标本用量少，灵敏度高，特异性好的大肠癌唾 液蛋白指纹图谱分子诊断模型的建立方法，就成为该技术领域急需解决的技术难题。
【发明内容】
[0008] 有鉴于此，本发明要解决现有肠癌检测技术对受试者依从性差，检查方法复杂，灵 敏度低的问题，提供了一种大肠癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模型建立方法。
[0009] 为了解决上述技术问题，本发明公开了一种大肠癌唾液蛋白指纹图谱分子诊断模 型建立方法，包括W下步骤：
[0010] (1)样品收集；
[0011] (2)纳米磁珠预处理；
[0012] (3)样品预处理:取出冷冻保存的唾液样品，冰上解冻，所有唾液样品均1次冻融， 取扣1唾液加入10μ1的U9裂解液，混合解育30min后，加入18扣1的Wash Buffer稀释(唾液最 终上样量为2.化1);
[0013] (4)唾液样品洗脱上样:③向每个装有纳米磁珠的PCR管中分别加入10化1预处理 后的唾液样品，混匀，置于室溫解育30min，将PCR管置于磁铁上解育Imin，去除上清液;④每 管加入10化1的Wash Buffer洗脱5min，然后将PCR管置于磁铁上解育Imin，去除上清液;再 重复步骤④操作一次，妒洗脱更干净，获得较纯的目的蛋白；⑤在PCR管中加入10μ1的 Elution Buffer洗脱5min，将PCR管置于磁铁上解育Imin，取化1上清液移至另一个PCR管 中；⑥将装有扣1上清液的PCR管中加入扣1的CHCA饱和溶液，充分混匀，至样品颜色发灰，而 没有明显的沉淀时，取化1混合溶液，加样到Au/Steel忍片上，惊干后放入仪器读取；
[0014] (5)质谱分析:采用质谱仪读所述Au/Steel取忍片信息，设置激光强度为190,灵敏 度为5;
[001引（6)数据采集；
[0016] (7)数据分析；
[0017] (8)建立诊断模型：用Biomarker Pattern Software 5.0.2采用决策树算法计算 出多个变量变化对两样本的判别价值，确定最佳的诊断模型。
[0018] 进一步的，所述步骤(1)样品收集方法为:肠癌组和正常对照组在取材前一天晚上 临睡前清水漱口，之后不再进食任何食物和药物，于第二天晨起后漱口前采用非刺激性唾 液采集方式空腹取材，前5min内的唾液自然吞下后开始收集，收集到的唾液置于冰浴中的 15ml唾液离屯、管内，4°C静置化后，3000r/min、4°C离屯、lOmin，冰浴上分装在1ml的EP管中， 每管20化1，于-80°C冰箱冷冻保存备用。
[0019] 进一步的，所述步骤(2)纳米磁珠预处理方法为:①取WCX纳米磁珠50μ1加入到200 μ1的PCR管中，置于磁铁上解育Imin，去除上清液;②再加入10化1的Wash Buff er洗脱5min， 在磁铁上解育Imin，去除上清液;再重复步骤②操作一次，运样洗脱更干净，质谱检测受到 干扰的可能性会更少。
[0020] 进一步的，所述步骤（6)数据采集方法为：用Ciphergen Proteinchip Software 3.2.1软件采集数据，纵坐标为峰强度，横坐标为蛋白质质荷比，收集数据的质荷比范围为 2000~25000m/z，信号收集位置40~60,平均每点收集20次，收集总点为100次，已知多肤标 准忍片标准，激光离子流0.5。
[0021] 进一步的，所述步骤（7)数据分析方法为：对位于2000~25000m/z峰值，用 Biomarker Wizard软件过滤噪音;设置初始的噪音过滤值为5，二次信噪比为2，W10%为最 小阔值进行聚类，经上述数据预处理后，采用t检验比较肠癌组和正常对照组唾液蛋白质质 谱数据，找出肠癌组和正常对照组之间具有统计学意义的差异表达蛋白质峰。
[0022] 进一步的，步骤(7)中，设置P<0.05,并选取肠癌组和正常对照组比值比率>3的 差异蛋白，所述肠癌组和正常对照组之间具有统计学意义的差异表达蛋白质峰有37个，其 中有30个差异蛋白质峰表达下调，7个差异蛋白质峰表达上调，所述37个差异表达蛋白质峰 具体如下：
[0023]
[0024]
[0025]
[0026] 进一步的，步骤(6)所述荷质比范围为2000~15000m/z。
[0027] 与现有技术相比，本发明可W获得包括W下技术效果：
[002引1)本发明将WCX与MALDI-T0F-MS技术相结合，进一步探索肠癌患者唾液差异表达 蛋白，发现了 312个肠癌差异蛋白质峰(P<0.05)，两组比值大于3(肠癌/正常对照>3,或者 正常对照/肠癌>3)，其中有37个差异蛋白质峰有统计学意义，其中有7个差异蛋白质峰肠 癌表达上调，28个差异蛋白