一种牛奶中抗生素残留的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及抗生素残留检测技术领域，具体是一种牛奶中抗生素残留的检测方法。
【背景技术】
[0002]牛奶富含除了膳食纤维外的人体所需要的所有营养物质，其营养之高是其他食物不可替代的。新鲜牛奶和奶制品己经成为人们(尤其是老人和儿童)生活食品中的重要组成部分。近年来，随着我国畜牧养殖业的迅速发展，奶产量大幅度提高，为了预防疾病的发生和治疗乳房炎等疾病，养殖者会在牛饲料中及饮用水中添加含有一定比例抗生素的饲料添加剂，然而，这样将不可避免地造成牛奶中抗生素的残留。若长期饮用含有抗生素的牛奶，牛奶中的抗生素可通过食物链进入人体，无疑是等于长期服用小剂量的抗生素。对抗生素过敏体质的人服用残留抗生素的牛奶后可引发过敏反应。正常饮用者，会导致体内的某些条件性致病菌易产生耐药性，一旦患病再用同种抗生素治疗很难奏效。抗生素残留不仅危害人类健康，同时也影响牛奶的品质。世界粮农组织、世界卫生组织的食品法对牛奶中抗生素最高残留量作了详细的规定。我国农业部2001年颁布实施了《无公害食品生鲜牛乳行业标准》。因此，建立一种简单、快速、有效地检测牛奶中多种抗生素残留的方法是非常必要的。
[0003]由于磺胺类、喹诺酮类、β-内酰胺类、四环素类、氯霉素类共5大类33种兽药的药物，其化学分子结构和化学性质差异较大，同时对牛奶中多种抗生素残留的同时检测有一定困难，目前还没有文献报道。对于牛奶中抗生素残留分析，固相萃取技术、固相微萃取技术以及基质固相分散等前处理技术已经被应用到样品前处理步骤中，以用来解决样品分析测试中的基质干扰问题。其中，固相萃取技术的应用最为广泛，但是应用在牛奶中抗生素残留检测的前处理中，固相萃取技术却普遍存在样品处理过程复杂、有毒试剂接触多、耗材消耗量大、需要额外氮吹、重现性差和无法实现全自动联机等问题。特别是四环素类等药物，由于其与蛋白质或者矿物质结合，形成结合态，因此更加加重了牛奶中残留抗生素的检测难度。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种成本低、检测速度快的牛奶中抗生素残留的检测方法，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0005]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
一种牛奶中抗生素残留的检测方法，具体步骤如下:
(I)将枯草芽孢杆菌的菌株接种于斜面培养基上，调节斜面培养基的PH值为6.5-7，于45-65 °C下进行优化培养48-72h，所述斜面培养基按照重量份的原料包括:蛋白胨2-4份、牛肉膏粉2.5-3.5份、酵母膏5-6份、琼脂10-20份、氯化钠0.4-0.6份、葡萄糖1-2份、磷酸氢二钾0.01-0.03份、蒸馏水100-120份； (2)用氢氧化钠溶液调节斜面培养基的pH值为7-8，进行转种继代培养24-36h后收集，再用生理盐水洗下菌苔，转移至无菌容器中，充分振荡后，过滤，制成悬浮液，于60-70°C下加热悬浮液8-12min，静置过夜后，以1500-1700r/min的速度离心15-25min，取上清液，再3800-4000r/min的速度离心5-10min，弃去上清液，如此反复离心洗涤3-5次后，用生理盐水将离心沉淀悬浮成枯草芽孢杆菌菌泥，调整其0D600值至0.25-0.35，于0_4°C下贮存、备用；
(3)按琼脂指示剂溶液与枯草芽孢杆菌菌泥的体积比为3-4:1加入琼脂指示剂溶液，于60-70°C下混合均匀，得反应液，将所述反应液0.2-0.4mL分别装入孔板的每一孔或微量反应器中，每孔或微量反应器中的枯草芽孢杆菌达到0.5-1.5 X 18Cfu，盖上铝塑膜并进行热合封口，于60-70°C倒置20-40min后，顺置冷却至常温，并装入铝塑袋，防潮和避光保存，制成检测试剂盒;所述琼脂指示剂溶液按照重量份的原料包括:琼脂1.5-3.5份、溴甲酚紫0.0008-0.0012份、氢氧化钠0.02-0.04份、蛋白胨1.0_1.5份、牛肉膏粉2.5_3.5份、氯化钠
0.4-0.6份、蒸馏水93-95份；
(4)在得到的所述试剂盒的每孔或微量反应器中加入牛奶样品0.05-0.25mL，用铝塑膜仔细密封，于50-60°C的水浴或恒温箱中恒温反应2.3-2.5h，阴性样品的试剂盒每孔或微量反应器中由蓝色变成黄色，变色范围pH为5.0-6.0，表示抗生素残留呈阴性；阳性样品不变色，表示抗生素残留呈阳性。
[0006]作为本发明进一步的方案:所述斜面培养基按照重量份的原料包括:蛋白胨2.5-3.5份、牛肉膏粉2.8-3.2份、酵母膏5.2-5.8份、琼脂12-18份、氯化钠0.45-0.55份、葡萄糖1.2-1.8份、磷酸氢二钾0.015-0.025份、蒸馏水105-115份。
[0007]作为本发明进一步的方案:所述斜面培养基按照重量份的原料包括:蛋白胨3份、牛肉膏粉3份、酵母膏5.5份、琼脂15份、氯化钠0.5份、葡萄糖1.5份、磷酸氢二钾0.02份、蒸馏水110份。
[0008]作为本发明进一步的方案:所述琼脂指示剂溶液按照重量份的原料包括:琼脂2-3份、溴甲酚紫0.0009-0.0011份、氢氧化钠0.025-0.035份、蛋白胨1.1-1.4份、牛肉膏粉2.8-3.2份、氯化钠0.45-0.55份、蒸馏水93.5-94.5份。
[0009]作为本发明进一步的方案:所述琼脂指示剂溶液按照重量份的原料包括:琼脂2.5份、溴甲酚紫0.001份、氢氧化钠0.03份、蛋白胨1.2份、牛肉膏粉3份、氯化钠0.5份、蒸馏水94份。
[0010]作为本发明再进一步的方案:所述步骤(2)中氢氧化钠溶液的浓度为l-2mol/L。
[0011]与现有技术相比，本发明的有益效果是:
本发明中枯草芽孢杆菌的菌株稳定，易保存和制备，能耐受加工过程中的热，在粗放的保存条件下也不易失活，操作简便、灵敏度高、成本低，快速检测，高通量检测，不需要昂贵的检测设备，检测限低。
【具体实施方式】
[0012]下面结合【具体实施方式】对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
[0013]实施例1
一种牛奶中抗生素残留的检测方法，具体步骤如下:
(I)将枯草芽孢杆菌的菌株接种于斜面培养基上，调节斜面培养基的PH值为6.5，于45°(:下进行优化培养48h，所述斜面培养基按照重量份的原料包括:蛋白胨2份、牛肉膏粉2.5份、酵母膏5份、琼脂10份、氯化钠0.4份、葡萄糖I份、磷酸氢二钾0.0l份、蒸馏水100份；
(2)采用浓度为lmol/L的氢氧化钠溶液调节斜面培养基的pH值为7，进行转种继代培养24h后收集，再用生理盐水洗下菌苔，转移至无菌容器中，充分振荡后，过滤，制成悬浮液，于60 0C下加热悬浮液8min，静置过夜后，以1500r/min的速度离心15min，取上清液，再3800r/min的速度离心5min，弃去上清液，如此反复离心洗涤3次后，用生理盐水将离心沉淀悬浮成枯草芽孢杆菌菌泥，调整其0D600值至0.25，于O 0C下贮存、备用；
(3)按琼脂指示剂溶液与枯草芽孢杆菌菌泥的体积比为3:1加入琼脂指示剂溶液，于60°C下混合均匀，得反应液，将所述反应液0.2mL分别装入孔板的每一孔或微量反应器中，每孔或微量反应器中的枯草芽孢杆菌达到0.5 X 18Cfu，盖上铝塑膜并进行热合封口，于60°C倒置20min后，顺置冷却至常温，并装入铝塑袋，防潮和避光保存，制成检测试剂盒;所述琼脂指示剂溶液按照重量份的原料包括:琼脂1.5份、溴甲酚紫0.0008份、氢氧化钠0.02份、蛋白胨1.0份、牛肉膏粉2.5份、氯化钠0.4份、蒸馏水93份；
(4)在得到的所述试剂盒的每孔或微量反应器中加入牛奶样品0.05mL，用铝塑膜仔细密封，于50°C的水浴或恒温箱中恒温反应2.3h，阴性样品的试剂盒每孔或微量反应器中由蓝色变成黄色，变色范围PH为5.0，表示抗生素残留呈阴性；阳性样品不变色，表示抗生素残留呈阳性。
[0014]实施例2
一种牛奶中抗生素残留的检测方法，具体步骤如下:
(1)将枯草芽孢杆菌的菌株接种于斜面培养基上，调节斜面培养基的PH值为6.6，于50°(:下进行优化培养56h，所述斜面培养基按照重量份的原料包括:蛋白胨2.8份、牛肉膏粉2.9份、酵母膏5.3份、琼脂13份、氯化钠0.48份、葡萄糖1.3份、磷酸氢二钾0.018份、蒸馏水108 份；
(2)采用浓度为1.2mol/L的氢氧化钠溶液调节斜面培养基的pH值为7.2，进行转种继代培养28h后收集，再用生理盐水洗下菌苔，转移至无菌容器中，充分振荡后，过滤，制成悬浮液，于62°C下加热悬浮液9min，静置过夜后，以1550r/min的速度离心18min，取上清液，再3850r/min的速度离心6min，弃去上清液，如此反复离心洗涤4次后，用生理盐水将离心沉淀悬浮成枯草芽孢杆菌菌泥，调整其0D600值至0.28，于1°C下贮存、备用；
(3)按琼脂指示剂溶液与枯草芽孢杆菌菌泥的体积比为3.2:1加入琼脂指示剂溶液，于62°C下混合均匀，得反应液，将所述反应液0.25mL分别装入孔板的每一孔或微量反应器中，每孔或微量反应器中的枯草芽孢杆菌达到0.8 X 18Cfu，盖上铝塑膜并进行热合封口，于620C倒置25min后，顺置冷却至常温，并装入铝塑袋，防潮和避光保存，制成检测试剂盒;所述琼脂指示剂溶液按照重量份的原料包括:琼脂2.2份、溴甲酚紫0.00095份、氢氧化钠0.028份、蛋白胨1.15份、牛肉膏粉2.9份、氯化钠0.48份、蒸馏水93.8份；
(4)在得到的所述试剂盒的每孔或微量反应器中加入牛奶样品0.lmL，用铝塑膜仔细密封，于52 °C的水浴或恒温箱中恒温反应2.35h，阴性样品的试剂盒每孔或微量反应器中由蓝色变成黄色，变色范围PH为5.2，表示抗生素残留呈阴性；阳性样品不变色，表示抗生素残留呈阳性。
[0015]实施例3 一种牛奶中抗生素残留的检测方法，具体步骤如下:
(1)将枯草芽孢杆菌的菌株接种于斜面培养基上，调节斜面培养基的PH值为6.8，于55°(:下进行优化培养51h，所述斜面培养基按照重量份的原料包括:蛋白胨3份、牛肉膏粉3份、酵母膏5.5份、琼脂15份、氯化钠0.5份、葡萄糖1.5份、磷酸氢二钾0