胸苷激酶1的荧光免疫层析检测方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种胸苷激酶I的检测方法及试剂盒，尤其涉及胸苷激酶I的荧光免疫层析检测方法及其检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]胸苷激酶I，又称TKl，是癌变细胞DNA合成必需的前体物，是调控细胞合成的特殊酶，其含量与细胞异常增殖紧密相关。肿瘤是一种细胞异常增殖的慢性疾病，是体内的正常细胞在环境因素影响下增生与异常分化形成的癌细胞，癌细胞不断增多就形成了实体瘤，不过这个过程很漫长，往往要通过几年时间达到一定的大小后才可以通过CT等检测设备检测出来。TKl就是在细胞癌变初期就可以检测到这些变化，进而在形成实体瘤之前就进行风险预警。TKl的检测方式是抽取人体血液进行检测得出相应的TKl值，根据TKl值来评估罹患肿瘤的风险。
[0003]TKl催化胸苷(TdR)为1-磷酸胸苷酸(TMP)，是细胞周期依赖酶，主要存在于细胞质中。当机体出现大量增殖细胞时，TK-1的水平迅速升高。一旦发生癌变，伴随着肿瘤细胞的急剧增殖，机体内TK-1的活性及含量都将升高，可超过正常水平的20?100倍。TKl是国际公认的细胞异常增殖标记物，它对检测血清中胸苷激酶I(STKl)的水平、动态了解体内癌细胞的增殖活动信息、评估肿瘤的治疗效果有着重要作用，能更早预示肿瘤复发风险。因此TKl的检测可用于评估手术效果、监测化疗效果、预测复发风险、判断肿瘤预后等。目前国内国外开发的TKl试剂盒多采用酶免疫方法，酶免疫方法检测操作复杂，人为操作易导致结果误差，机器操作需要昂贵的生化仪器，且检测时间长，检测少量样本时成本较高。
[0004]现有技术荧光层析免疫分析方法是一种微量分析方法，是免疫荧光技术和传统免疫层析技术相结合发展创新的一种定量新型检测技术。该技术在保留胶体金免疫层析技术操作简便、检测快速、便携性强的优点外，还通过荧光示踪增强技术实现了检测结果的精确定量，方便对物质进行定性或定量分析，具有高灵敏度、选择性强、需样量少和操作简便等优点。其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，采用免疫胶体金等可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。
[0005]中国专利CN101231288B公开了一种基于磁性纳米微粒的荧光免疫定量检测TKl的试剂盒，通过将TKl固定于氨基硅烷化的超顺磁性纳米颗粒固定化载体表面，采用竞争法，以辣根过氧化物酶为酶标记、对羟基苯丙酸为荧光底物，实现TKl的检测。然而该方法在检测时需要的免疫反应时间较长，待测TKI先与酶标记的TKI单克隆抗体反应，再加入TKI包被的磁性微球发生竞争反应，洗涤后在磁场下分离，最后加入荧光底物进行显色并测量，检测所需步骤较长，过程约1.5?3h。
[0006]中国专利CN101275954B公开了一种利用免疫层析法简便测定TKl的预警芯片，由包被有一抗TKl单克隆抗体的条状纤维层析固相载体NC膜、滤样纸、吸水玻璃纤维纸、标记有胶体金的二抗TKl单克隆抗体结合物的聚酯膜粘贴在PVC塑料片组成，该方法检测简单，然而并不能准确定量TKl，对TKl在癌症治疗过程监控不能提供明确的数据。
[0007]因此，如何开发检测时长短、操作方便、检测结果精确的TKl检测方法和检测产品成为亟待解决的问题。
【发明内容】
[0008]为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种灵敏度高、准确度高、操作简单、成本低的胸苷激酶I的检测方法及试剂盒。
[0009]本发明一种胸苷激酶I的荧光免疫层析检测方法，包括以下步骤:
[0010]步骤I)探针固定垫制备:将胸苷激酶I单克隆抗体按比例与活化白蛋白荧光胶乳微粒偶联反应制得胸苷激酶I单克隆抗体荧光胶乳微粒，再将所述胸苷激酶I单克隆抗体荧光胶乳微粒与羊抗兔IgG荧光胶乳微粒按一定比例混合得到混合荧光胶乳微粒，所述混合荧光胶乳微粒用荧光探针微球稀释液稀释后喷在玻璃纤维上制得探针固定垫；
[0011]步骤2)免疫层析试纸条制备:将样品垫、探针固定垫、层析膜、吸水纸依次贴在PVC衬板上，将所述胸苷激酶I单克隆抗体包被在层析膜的检测线上，将所述羊抗兔IgG包被在层析膜控制线上，进而制得免疫层析试纸条，所述层析膜优选硝酸纤维素膜；
[0012]步骤3)样品稀释液制备:将包括有牛血清白蛋白、表面活性剂、分散剂和防腐剂的混合物与缓冲液混合均匀制得样品稀释液；
[0013]步骤4)样品检验:取血清样品混合至所述样品稀释液，加入免疫层析试纸条进行免疫层析反应，层析反应结束后经荧光检测器荧光检测。
[0014]本发明进一步地，步骤I)中，活化白蛋白荧光胶乳微粒的制备是先将荧光胶乳微粒与活化剂反应制得活化荧光胶乳微粒，再与白蛋白按比例偶联反应得白蛋白荧光胶乳微粒，所述白蛋白与活化荧光胶乳微粒的重量比为0.05:100?0.2:100，所述白蛋白荧光胶乳微粒进一步与活化剂反应制得所述活化白蛋白荧光胶乳微粒。
[0015]本发明更进一步地，所述白蛋白的种属包括人、牛、羊或鼠。
[0016]本发明更进一步地，步骤I)中，所述羊抗兔IgG荧光胶乳微粒的制备是将羊抗兔IgG按比例与活化荧光胶乳微粒偶联反应制得，所述羊抗兔IgG与活化荧光胶乳微粒的混合重量比为0.05:100 ?0.2:100。
[0017]本发明更进一步地，步骤I)中，所述活化剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，二者重量比为1:6?1:1，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与荧光胶乳微粒的重量比为1:100?5:100。三者混合后可在室温下反应0.5?lh。
[0018]本发明进一步地，步骤I)中，所述胸苷激酶I单克隆抗体与活化荧光胶乳微粒的混合重量比为0.05:100?0.2:100，混合后可在室温下偶联反应I?5h;所述胸苷激酶I单克隆抗体荧光胶乳微粒和羊抗兔IgG荧光胶乳微粒相混合的比例2:1?6:1，混合后室温下偶联反应I?5h。
[0019]本发明进一步地，步骤I)中，将混合荧光胶乳微粒用荧光探针微球稀释液稀释2?6倍，以2?6ul/cm的速度均匀喷在宽度为0.7?1.3cm的玻璃纤维上，在30?55°C下干燥2?24h后制得探针固定垫。
[0020]本发明进一步地，所述荧光探针微球稀释液为含有蔗糖、牛血清白蛋白和表面活性剂的缓冲液，所述缓冲液包括PBS缓冲液、Tr i s缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或几种，所述表面活性剂为吐温20或吐温80。
[0021]本发明进一步地，步骤3)中，所述缓冲液包括PBS缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或几种，所述表面活性剂为吐温20、吐温80、曲拉通X-100或聚乙二醇，所述防腐剂为叠氮钠或proclin，所述分散剂为聚乙烯吡咯烷酮10K、聚乙烯吡咯烷酮40K或聚乙烯醇。
[0022]另一方面，本发明一种胸苷激酶I的荧光免疫层析检测试剂盒，包括试剂盒体以及稀释液瓶，所述试剂盒体包括免疫层析检测卡，所述免疫层析检测卡包括PVC衬板以及固定在PVC衬板上的样品垫、探针固定垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述样品垫搭接在探针固定垫上，所述探针固定垫和吸水纸分别搭接在所述硝酸纤维素膜两侧，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和控制线，所述检测线内包被有胸苷激酶I单克隆抗体，所述控制线内包被有羊抗兔IgG;所述探针固定垫为由胸苷激酶I单克隆抗体荧光胶乳微粒和羊抗兔IgG荧光胶乳微粒的混合荧