一种高性能的人尿液微量白蛋白检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是生物技术领域，具体涉及的是一种高性能的人尿液微量白蛋白检 测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 人体代谢正常情况下，尿中的白蛋白极少，具体到每升尿白蛋白不超过20mg(〈 20mg/L)，所以叫微量白蛋白。如果在体检后发现尿中的微量白蛋白在20mg/L-200mg/L范围 内，就属于微量白蛋白尿，如果患者能够经过规范的修复肾单位，逆转纤维化治疗，尚可彻 底修复肾小球，消除蛋白尿，尿常规尿蛋白的显示为阴性(_)或(+_)。而当尿中微量白蛋白 超过200mgAJ寸，就应该引起注意了，此时证明肾病患者已有大量白蛋白漏出，可能出现低 蛋白血症，肾病发展离不可逆期只有一步之遥，尿常规测试尿蛋白阳性( + )-(+++)，如果不 及时进行医治，就会进入尿毒症期。
[0003] 检查尿微量白蛋白的临床意义何在？临床中，通常应用尿微量蛋白指标来监测肾 病的发生。尿微量蛋白的检测是早期发现肾病最敏感、最可靠的诊断指标。通过尿微量白蛋 白的数值，结合发病情况、症状以及病史陈述就可以较为准确的诊断病情，判断病情进入了 纤维化那个阶段。
[0004] 微量白蛋白尿也是整个血管系统改变的征象，并可认为是动脉病变的"窗口"，因 为它是肾脏和心血管系统改变的早期指征，故而急需开发一种能够检测人尿液微量白蛋白 的试剂盒，但目前市面上检测微量白蛋白的试剂盒普通存在着线性范围较低，抗原过剩不 够的现象。
【发明内容】
[0005] 为了改善上述存在问题，本发明提供了一种高性能的人尿液微量白蛋白检测试剂 盒。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0007] -种高性能的人尿液微量白蛋白检测试剂盒，包括试剂2，所述试剂2为标记有兔 抗人白蛋白多克隆抗体的胶乳颗粒溶液。其中，试剂1选用常规的磷酸盐缓冲液、Good's缓 冲液或甘氨酸缓冲液即可。
[0008] 值得说明的是，本发明是针对试剂盒中的试剂2进行改进，然而试剂1选用市面上 的常用试剂均可。
[0009] 由于试剂2生产中过低的抗体使用量，在满足样本抗体比例不变的情况下，需要样 本稀释比例提高，导致过低的样本量，试剂灵敏度无法满足临床使用。抗体量过大，在标记 过程中容易导致胶乳凝聚，试剂批间差异难以控制，并且试剂成本过高，无法接受。胶乳粒 径过小，试剂灵敏度无法保证，胶乳粒径过大，胶乳微球颗粒悬浮受到影响，容易沉降，故 而，本发明的胶乳颗粒粒径范围为150nm~350nm，每升试剂2中抗体的用量为12ml~22ml 〇
[0010] 具体地，本发明是采用化学偶联方法将兔抗人白蛋白多克隆抗体标记在胶乳颗粒 上。
[0011] 作为一种优选，所述试剂盒对样本进行检测时，样本与抗体的体积比为1:12~1: 22。通过上述限定，能够避免样本与抗体比例过高或过低，因为样本与抗体比例过高，将导 致反应体系中抗原过多，降低试剂的抗原过剩范围甚至线性范围;过低时，将导致反应体系 中抗原量太少，试剂灵敏度无法满足临床使用。
[0012] 所述试剂盒是基于胶乳免疫比浊法检测人尿液微量白蛋白，其线性范围为6.Omg/ L~1000.0mg/L，抗原过剩范围达到50000mg/L。
[0013] 具体地，所述兔抗人白蛋白多克隆抗体为Dako公司生产的兔抗人白蛋白多克隆抗 体，或为GeneTex公司生产的兔抗人白蛋白多克隆抗体。
[0014] 另外，所述试剂盒适用于具有自动样本稀释功能的全自动分析仪器，如迪瑞、迈 瑞、Roche、Hitachi、01ympus等多种全自动生化分析仪。
[0015] 本发明具有以下优点及有益效果：
[0016] 1、使用本发明的试剂盒对人尿液中的微量白蛋白进行测定，因线性范围较进口试 剂提高3倍，使用时大幅度减少了需要人工稀释复测的样本数量，大幅度节约了人力和试 剂，极大地提高了检测效率，并节约了成本。
[0017] 2、本发明的试剂盒抗原过剩范围广，有效避免了临床结果被低估甚至假阴性结果 的出现，测定结果可靠性相比进口试剂更高。
[0018] 3、本发明采用成熟的化学偶联胶乳标记方法，能够规模化生产，且能够配套市面 上绝大多数自动化分析仪器使用，便于推广使用。
[0019] 4、采用本发明的试剂盒进行检测，可替代进口试剂，节约病患开支。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明-实施例1的线性稀释图。
[0021] 图2为本发明-实施例2的线性稀释图。
[0022]图3为本发明-实施例3的线性稀释图。
[0023]图4为本发明-实施例4的线性稀释图。
[0024]图5为本发明-实施例5的线性稀释图。
[0025]图6为本发明-实施例6的线性稀释图。
[0026]图7为本发明-实施例7的线性稀释图。
[0027]图8为本发明-实施例8的线性稀释图。
[0028] 图9为本发明-实施例9的线性稀释图。
[0029] 图10为本发明-实施例10的线性稀释图。
[0030] 图11为本发明-实施例11的线性稀释图。
【具体实施方式】
[0031] 下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的实施方式不限于下列实施 例。
[0032] 由于正常人尿液中白蛋白含量较低，通常<20mg/L，而免疫比浊法的检测极限通 常为5mg/L，用于检测血液中白蛋白的免疫比浊法试剂用于检测尿液的话，显然灵敏度不 够，即由于检测极限与阴阳性分界点很接近，正常人低于检测极限会出现大量的零值及负 值，早期病患也会因为阴阳性分界点灵敏度底测试重复性不好容易漏诊。所以该项目必须 采用灵敏度更高的检测方法，同样在高通量的全自动分析仪器上，目前在国内外用于该项 目研究的积水医疗科技的尿微量白蛋白试剂即为胶乳免疫比浊法试剂，胶乳免疫比浊法检 测的灵敏度高、结果稳定。
[0033]但是，单纯的胶乳免疫比浊法试剂提高灵敏度的同时，降低了试剂检测线性范围。 大量肾病样本超过试剂检测线性范围需要手工稀释后重复测定，浪费人力及试剂。多数全 自动生化分析仪和特定蛋白分析仪都具有样本自动稀释功能，能够在初次测定时就先自动 稀释样本再参与后续反应，即避免了人工误差，又提高了效率，发明人通过研究发现使用恰 当比例，由仪器自动预稀释样本，能够在保证检测灵敏度满足检测需求的同时大幅度扩宽 试剂盒的检测线性范围。
[0034]另外，免疫检测（包括胶乳免疫比浊）需要遵循海登博格原理，可见百度百科抗原 抗体反应原理，抗原抗体的比例在检测过程中尤为重要，反应体系中抗体浓度一定时，随着 抗原浓度的增加，抗原抗体复合物沉淀量增加，逐渐达到平衡，当抗原浓度过高时，将出现 沉淀解聚甚至不沉淀的情况，即HOOK效应或抗原过剩现象(Antigen excess)，在免疫检测 系统中，该现象将导致被测物浓度被低估甚至假阴性结果出现。所有的免疫检测，包括胶乳 免疫比浊，都必须避免高浓度样本出现HOOK效应。比如检测微量白蛋白就需要避免严重的 糖尿病肾病患者或高血压肾病患者出现测定值被低估甚至假阴性结果。在样本与试剂2比 例一定的情况下，试剂2中抗体的使用量以及效价对于试剂抵抗HOOK效应的能力（即抗原过 剩范围）至关重要。发明人比较发现，Dako公司的兔抗人白蛋白多克隆抗体具有非常高的效 价(titre)，即有效抗体浓度高，是微量白蛋白检测的较理想的选择。
[0035] Diasys公司的微量白蛋白试剂在线性范围（3~350mg/L)及抗原过剩范围仅达到 60000mg/L，即浓度超过60000mg/L的样本可能会出现被低估(测定结果低于350mg/L，无法 提醒医生是需要稀释复测的高值样本)甚至假阴性(低于阴性参考值20mg/L)，在抗原抗体 比例一定的情况下，抗原过剩范围和线性范围成反比，特别是在高浓度区域，线性范围提高 1%，抗原过剩范围往往降低超过10%。结果:线性存在明显缺陷；临床上糖尿病肾病人的尿 液中微量白蛋白含量大于200mg/L，早期肾小球肾炎病患即可超过500mg/L，即使用Diasys 试剂在临床使用，80%的病患需要稀释后复测，但仅25%左右的病患超过1000mg/L，如果线 性范围达到l〇〇〇mg/L，在临床使用中将大幅度降低需要稀释复测的样本。而终末期肾病患 者，微量白蛋白却可尚达l〇〇〇〇mg/L，甚至个别肾炎后期患者可尚达30000mg/L以上;所以?两 足临床使用的微量白蛋白试剂抗原过剩需要至少超过30000mg/L。但肾病发病很隐匿，知晓 率极低（知晓率<10%)，通常就医时已经是终末期，Diasys试剂在临床使用中遇到了因为 线性范围较窄，大量标本需要手工稀释而增加了医生的工作量和检测的误差的情况，故而 本发明的发明人研究出了如下试剂盒，解决了上述问题。
[0036] 实施例1
[0037]本实施例的胶乳颗粒粒径为230nm，每升试剂2标记17ml Dako公司生产的兔抗人 白蛋白多克隆抗体(货号:Q〇328)，使用胶乳免疫比浊中最常规的磷酸盐缓冲液作为试剂1， 采用自动分析仪最常见参数试剂1:试剂2比例250μ1:50μ1，样本预先稀释60倍后加入3μ1稀 释过的样本到反应体系中（即样本与抗体比例为1:17)。
[0038] 使用Hitachi7170全自动生化分析仪，波长为660nm单波长，两点终点法18-34读点 计算，数据如下：
[0039]表1校准数据 [0040]
[0041 ] 表2线性稀释
[0042]
[0043] 具体如图1及表2所示，a)线性相关系数r 2 0.990; b)在6.0-20.0 mg/L范围内，线性 绝对偏差不超过± 3. Omg/L;在20.1-1000.0 mg/L范围内，线性相对偏差不超过± 15.0%，说 明线性合格。
[0044] 表3检测下限
[0045]
[0046] 表4抗原过剩验证
[0047]
[0048] 从表1~4可以看出，本实施例的微量白蛋白试剂，在6.0-20.0 mg/L范围内，线性绝 对偏差未超过±3. Omg/L;在20.1-1000.0 mg/1范围内，线性相对偏差未超过± 15.0%，且检 测下限也能达到3 . Omg/L(精密度CV<