检测动物源食品中残留药物的方法及液质数据库的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，具体而言，涉及一种用于检测动物源食品中残留药物 的液质数据库及其使用方法。
【背景技术】
[0002] 动物源食品在国际农产品贸易中占相当比重，针对动物源食品中药物残留的法规 限制越来越严格，以日本06年5月实施的"肯定列表"制度为例，其对236种兽药和饲料添 加剂制定了具体限量标准，而在国内食品安全领域，从早期的"氯霉素、硝基呋喃"到后来的 "孔雀石绿、瘦肉精"，因药物残留导致的食品安全事件频发凸显我国食品安全监管控制体 系技术支撑能力不足，迫切需要建立多种类残留快速筛选方法。目前，针对动物源食品中药 物残留检测技术和方法已由单残留分析发展到了单种类多残留分析，03年以来，以物质种 类界分的多残留检测标准占据了残留分析国家和行业标准的70%以上。同时期，质谱分析 已经成为多残留检测的主要技术手段，以欧盟2002/657/EC法规为蓝本的技术指标规则也 为国际上所承认和接受。随着残留分析技术的发展，多种类残留分析在信息量、检测效率等 多方面具有优势使其成为研发热点，且质谱设备领域如Q-TOF，Q-Trap等串联质谱仪的实 用化，以高级质谱技术为基础的谱库比对分析逐渐成熟也为多种类残留快速分析提供了技 术可能。然而，无论是在方法开发、验证和标准化还是在法规完善等方面，同时检测多种类 残留都存在较多困难：
[0003] (1)不同种类兽药物化性质差别很大，极性覆盖范围宽，在不同基质中残留形态不 一，个别兽药尚需衍生化方能有效检测，因此在通用前处理方法和色谱一次进样分析上难 以实现有效突破；
[0004] (2)法规对不同兽药（禁用药物和限用药物）的限量要求和使用规定不一，多种类 残留检测验证规则尚未完善；
[0005] (3)方法开发需要的空白基质难以获得，混合标准溶液制备困难；
[0006] (4)仪器的分析能力。在构建液质谱库方面，尽管有商业化谱库如AB公司法医毒 物数据库（1250种目标分析物）、兽药数据库（139种目标分析物）Freiburg大学医院的 小分子药物数据库等，但存在如下应用局限：
[0007] 1)仅有MS/MS数据，无色谱体系信息特征；
[0008] 2)无在线信息特征；
[0009] 3)无统一前处理方法和仪器分析相偶联；
[0010] 4)缺乏基质标准数据。
[0011]因此，在现有条件下，很难有效实现基于液质谱库技术的多种类残留快速筛查分 析。
【发明内容】
[0012] 鉴于目前国内外在动物源食品多种类残留药物分析中存在的样品通用性前处理、 仪器快速分析和筛选方法验证等技术难点。本发明以建立动物源食品中高风险药物多种 类残留快速筛选检测体系为目的，通过采用多溶剂体系分段组合提取、建立样品高通量通 用性前处理技术、综合优化色谱体系实现多目标分析物宽极性范围液相色谱有效保留与分 离、并通过构建涵盖色谱-质谱多维信息的液相色谱-质谱/质谱数据库及依据法规要求 和检测实践进行筛选方法验证等关键技术内容的研发，突破多种类残留分析技术难关，建 立一个以多种类残留通用性前处理技术、快速分离体系和液质谱库为技术特征的开放性快 速分析平台和有效筛查检测技术体系。
[0013] 本发明针对103种限量值在1.0 μ g/kg以上高风险残留药物（B类残留物质）作 为检测目标，该组药物见表1，
[0014] 表1.目标分析物化学信息
[0015]
[0025] 本发明首先涉及一种检测动物源食品中高风险药物多种类残留的快速筛选液质 谱库的构建方法，所述的动物源食品为禽蛋类食品或蜂蜜类食品，具体包括如下步骤，
[0026] (1)标准工作溶液的制备；
[0027] a.雄性激素类物质混合标准储备溶液（0.01g/L):包括群勃龙、甲基睾酮、诺龙、 丙酸诺龙、苯丙酸诺龙、丙酸睾酮、去氢睾酮、去氢甲睾酮，配制溶剂为乙腈；
[0028] b.孕激素类物质混合标准储备溶液（0.01g/L):包括甲羟孕酮、甲羟孕酮乙酸酯、 甲地孕酮、乙酸酯孕酮、美仑孕酮、乙酸酯17 a -羟孕酮，配制溶剂为乙腈；
[0029] c.糖皮质激素类物质混合标准储备溶液（0.01g/L):包括倍氯米松、氟氢可的松 乙酸酯、氢化可的松、甲基泼尼松龙、泼尼松、可的松，配制溶剂为甲醇；
[0030] d. 5-硝基咪唑类药物及其代谢产物混合标准储备溶液（0. 01g/L):包括异丙硝 唑、特硝唑、羟基甲硝哒唑、羟基二甲硝咪唑、羟基异丙硝唑，配制溶剂为乙腈；
[0031 ] e.硝基呋喃代谢产物以及2-硝基苯甲醛衍生化硝基呋喃代谢产物混合标准储备 溶液（0. 01g/L):呋喃西林代谢产物、呋喃妥因代谢产物、呋喃唑酮代谢产物、呋喃他酮代 谢产物及它们各自的2-硝基苯甲醛衍生化物，配制溶剂为乙腈；
[0032] f.氟喹诺酮类物质混合标准储备溶液（0.01g/L):包括沙拉沙星、恩诺沙星、环丙 沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、洛美沙星、培氟沙星、司帕沙星、双氟沙星、达氟沙星、麻保沙星、 奥比沙星、依诺沙星、氟甲喹，配制溶剂为乙腈；
[0033] g.喹诺酮类物质混合标准储备溶液（0.01g/L):包括吡哌酸、恶喹酸、吡咯酸、萘 啶酸，配制溶剂为乙腈；
[0034] h. β -受体激动剂类物质混合标准储备溶液（0. 01g/L):包括沙丁胺醇、叔丁喘 宁、莱克多巴胺、沙美特罗、非诺特罗、甲氧酪胺、氯丙那林、喷布洛尔，配制溶剂为乙腈；
[0035] i&j.磺胺类物质及其增效剂混合标准储备溶液（0.01g/L):包括磺胺嘧啶、磺 胺-5_(对）甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺喹恶啉、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺-6-(间）甲氧嘧 啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺甲恶唑、磺胺噻唑、磺胺醋酰、磺胺二甲恶唑、磺胺二甲异恶唑、磺胺 甲噻二唑、磺胺氯哒嗪、磺胺二甲异嘧啶、磺胺吡啶、磺胺苯吡唑、磺胺氯吡嗪、磺胺甲基嘧 啶、磺胺硝苯、磺胺苯酰、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺、磺胺脒、甲氧苄啶，配制溶剂为乙腈；
[0036] k.大环内酯类物质混合标准储备溶液（0. 01g/L):包括螺旋霉素、吉他霉素、替米 考星、麦迪霉素、克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素、交沙霉素、泰乐霉素、竹桃霉素、红霉素，配 制溶剂为乙腈；
[0037] 1.林可霉素标准储备溶液（0. 01g/L)，配制溶剂为乙腈；
[0038] m.四环素类物质混合标准储备溶液（0.01g/L):包括四环素、土霉素、金霉素、强 力霉素，配制溶剂为乙腈；
[0039] η.聚醚类物质混合标准储备溶液（0. 01g/L):包括盐霉素、甲基盐霉素、莫能菌 素、马杜霉素、拉沙洛菌素，配制溶剂为甲醇；
[0040] 0.染料类物质混合标准储备溶液（〇.〇lg/L):包括孔雀石绿、隐色孔雀石绿，配制 溶剂为甲醇；
[0041] 99种物质混合标准工作溶液（0. 5mg/L):移取上述各混合标准储备溶液（硝基呋 喃代谢产物及其2-硝基苯甲醛衍生物混合标准储备溶液除外）0. 5mL于10mL容量瓶中，用 乙腈定容至刻度，混匀；
[0042] 103种物质混合标准工作溶液（0. 5mg/L):移取上述各混合标准储备溶液（硝基呋 喃代谢产物混合标准储备溶液除外）〇. 5mL于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混匀；
[0043] 硝基呋喃代谢产物混合标准工作溶液（0. 5mg/L):分别移取硝基呋喃代谢产物混 合标准储备溶液0. 5mL于10mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，混匀。
[0044] (2)分析前处理，采用快速酶解（释放结合态残留）+快速固相萃取（SPE)的提取 净化技术进行待测样本分析前处理工作，具体的提取净化过程如下：
[0045] a)称取均质样品2g(精确到0· Olg)，置于50mL聚四氟乙烯离心管中（如需做添 加样品，在此步骤加入适当浓度的混合标准工作溶液，并于暗处放置30min)，加入乙酸铵缓 冲液（0· 2mol/L，pH 5. 2) 3. 75mL，Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液 200 μ L，β -葡糖苷酸 / 硫 酸酯酶50 μ L，涡旋混匀，50°C水浴振荡2h，放冷至室温，于10°C，15000rpm离心5min，得上 清为提取液A，留取待用。离心残渣中加入1 %甲酸乙腈溶液5mL，涡旋混匀，50°C水浴振 荡30min，放冷至室温，于10°C，15000rpm离心5min，将上清于30°C吹至lmL，加入甲酸铵 (5mmol/L)-甲酸（0. 1% )-水溶液3mL，得提取液B，留取待用。分别取提取液A、B各400μ L 于Eppendorf管中，于4°C，20000rpm离心10min，取上清400 μ L，加入甲酸铵（5mmol/L)-甲 酸（0. 1 % )-水溶液400 μ L，超声lmin，过0. 22 μ Μ微孔滤膜，液相色谱-串联质谱测定。
[0046] b)鸡蛋、蜂蜜筛查呋喃代谢产物：称取均匀试样2g(精确到0.0 lg)，置于50mL 聚四氟乙烯离心管中加入0· lmol/L盐酸溶液3. 8mL，2-硝基苯甲醛溶液（0· lmol/ L) 200 μ L (如需制备样品添加，在此步骤加入适当浓度的硝基呋喃代谢产物工作溶液，暗处 放置30min，并调节加入液体体积总和为4mL)，涡旋混匀，50°C水浴振荡2h，放冷至室温，于 1