一种抗cuzd1抗体免疫层析试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001] 本实用新型涉及一种层析试纸条，属于医学免疫分析检测领域。 技术背景
[0002] 炎性肠病（IBD)包括克罗恩病（CD)与溃疡性结肠炎（UC)，其病因迄今仍不明确。 IBD在全球范围内分布具有明显地域差异性，其在欧美国家高发，尤其是北美和北欧。以前 认为IBD在亚洲国家包括中国发病率很低，但近20年来中国报道的临床IBD病例越来越 多，其发病呈上升趋势。目前的临床诊断条件下，在UC与CD及IBD与非IBD的鉴别诊断上 有时很困难，在缺乏组织学证据时，需有更多相对特异性的标志物为诊断提供帮助。研究发 现，多种非侵入性的生物活性标志物对IBD的诊断及炎症活动性的评价具有重要意义。
[0003] CUB带状疮疹透明区样域蛋白I(CUZDl)是近期发现的存在于胰腺中的一种自身 免疫性抗原，它的自体免疫性抗体以网状颗粒形式存在于炎症性肠病（IBD)，尤其是克隆恩 病（CD)患者体内。据临床研究分析，高于30%的CD患者体内能够用免疫荧光技术检测出 CUZDl抗体的存在。大量研究反映出疮疹透明区样域蛋白I(CUZDl)自体免疫抗体与炎症性 肠病（IBD)尤其是克隆恩病（CD)具有高度的相关性。
[0004] 目前市场上⑶ZDl抗体的检测方法多为酶联免疫吸附法（ELISA)及间接免疫荧光 (Indirect immunofluorescence，IFA)检测技术。ELISA法检测可用于高通量标本测定，灵 敏度也比较高，目前也被广泛认可，但其操作比较繁琐，需要多次加样洗涤及孵育步骤，完 成整个实验过程需要3小时左右，需要酶标仪，对于实验人员专业技术要求比较高，同时受 到各种环境条件的影响，对实验带来诸多不便。
[0005] 间接免疫荧光检测技术是把抗原细胞固定在载玻片上，荧光染色用荧光显微镜进 行观察，该技术具有高特异性，但由于显微镜观察需要主观判断，对检验人员的要求高，并 且依赖于荧光显微镜，使用不便。
[0006] 免疫层析法（immunochromatography)是近几年来兴起的一种快速诊断技术，其 原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的纤维 素一端浸入样品（尿液或血清）后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至 固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，形成肉眼可见的检 测带。现有的免疫层析试纸条产品常用的示踪标记粒子有纳米金、纳米硒、彩色胶乳等等， 其中以纳米金应用最为广泛，纳米金也称为胶体金。
[0007] 以胶体金作为失踪标记物的免疫层析技术特称为免疫胶体金技术（Immune colloidal gold technique，GICT)。胶体金是由氯金酸（HAuC14)在还原剂如白磷、抗坏 血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳 定的胶体状态而得名。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成 牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白 质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些 物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因 而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。胶体金层析法的优 点主要包括：（1)使用方便快速，便于基层使用和现场使用，所有反应能在15分钟内完成； (2)成本低，不需要特殊的仪器设备；(3)应用范围广，可适应多种检测条件；(4)可以进行 多项检测，若阳性样本比较难获得，多项检测可以节省样品，降低成本；（5)标记物稳定，标 记样品在4°C贮存两年年以上，无信号衰减现象；(6)胶体金本身为红色，不需要加入发色 试剂，省却了酶标的致癌性底物及终止液的步骤，对人体无毒害。
[0008] 表面带活性基团的彩色胶乳微球也可以作为免疫层析的示踪剂，与胶体金技术一 样，彩色胶乳标记免疫层析技术也具有操作简便、试剂稳定、快速出结果、可室温保存等优 点。彩色胶乳标记是将不同直径范围0.1 um-Ium彩色胶乳微球与含有羧基、氨基、羟基等酯 类或其他大分子物质共价结合，使这些大分子标记上颜色，当在检测线或质控线上富集停 留后形成肉眼可见的彩色条带。
[0009] 目前国内商品化的CUZDl试剂是间接免疫荧光试剂，用于IBD诊断的灵敏度为 8-20 %，特异性为95 %以上，本实用新型的⑶ZDl免疫层析试纸在保证特异性的情况下，各 种试纸条用于IBD诊断的灵敏度均比现有产品有显著提高。 【实用新型内容】
[0010] 本实用新型所要解决的技术问题是为了克服现有方法的不足，将免疫层析法应用 到抗CUZDl抗体的检测中，采用间接免疫法来实现对样品中的CUZDl抗体进行检测，通过把 CUZDl抗原蛋白包被在结合垫或分析膜检测带上，实现对样品中CUZDl抗体的高特异、高准 确性的检测，快速筛查抗CUZDl抗体阳性标本，为临床炎症性肠病等自体免疫性疾病提供 快速的辅助诊断。
[0011] 本实用新型所要解决的技术问题在于提供一种免疫层析法抗⑶ZDl抗体测试纸 条。
[0012] 本实用新型所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现：
[0013] -种抗CUZDl抗体免疫层析试纸条，包括样品垫（1)、结合垫（2)、分析膜（3)、吸水 垫（6)、底板（7)、检测带T线⑷和质控带C线（5)，所述底板的上部贴合有分析膜，所述分 析膜上部的两端分别贴合有结合垫和吸水垫，所述结合垫上部的一端贴合有样品垫，所述 检测带T线和质控带C线设置在分析膜上。
[0014] 所述的结合垫（2)包被胶体金或彩色胶乳标记物。
[0015] 优选例1中，所述的结合垫⑵包被有标记的⑶ZDl抗原蛋白，所述的检测带T线 (4)包被有抗人IgG，所述的质控带C线（5)包被有CUZDl的单克隆或多克隆抗体的一种或 多种。
[0016] 所述的CUZDl单克隆或多克隆抗体是指用CUZDl抗原蛋白作为免疫原所获得的鼠 源、兔源、马源、豚鼠源、骆驼源的单克隆抗体或多克隆抗体。
[0017] 优选例2中，所述的结合垫（2)包被有标记的⑶ZDl抗原蛋白和标记物b层；所述 的检测带T线（4)包被有抗人IgG，所述的质控带C线（5)包被有蛋白C。
[0018] 优选例3中，所述的结合垫（2)包被有标记物a层和标记物b层；所述的检测带T 线⑷包被有CUZDl抗原，所述的质控带C线（5)包被有蛋白C。
[0019] 所述标记物a层的标记蛋白为抗人IgG单克隆抗体、抗人IgG多克隆抗体、葡萄球 菌A蛋白（SPA)、链球菌G蛋白（Protein G)中的一种或多种。
[0020] 所述的抗人IgG多克隆抗体为鼠源、马源、羊源、兔源、骆驼源或豚鼠源中的一种； 所述的抗人IgG单克隆抗体为鼠源、骆驼源或兔源中的一种。
[0021] 所述的控制线上的蛋白C与标记物b层中的标记蛋白B同时或不同时为单克隆抗 体或多克隆抗体中的一种，并且标记物b层中的标记蛋白B和质控线上的蛋白C可发生特 异性结合形成免疫复合物。所述的多克隆抗体为鼠源、马源、羊源、兔源、骆驼源或豚鼠源中 的一种，所述的单克隆抗体为鼠源、骆驼源或兔源中的一种。
[0022] 本实用新型所用的包被在质控带C线上的蛋白包括但不限于：CUZDl的特异性单 抗或多抗、动物的免疫球蛋白或抗其抗体，但必须能与结合垫b层的标记蛋白发生免疫结 合反应，形成免疫复合物。比如结合垫b层的包被蛋白是标记的⑶ZD1，质控带的包被蛋白 是任何动物来源的抗CUZDl抗体；如果结合垫b层的包被蛋白是鼠 IgG，质控带的包被蛋白 是任何动物来源的抗鼠 IgG的单抗或多抗。选用哪一对的结合垫b层蛋白和质控带C线蛋 白不是本实用新型的关键，实施例例举几组常用的结合垫b层标记蛋白与质控带C线包被 蛋白组合，其目的不是限制该组合类型。
[0023] 所述的CUZDl抗原蛋白为通过原核/真核表达系统克隆化基因获得，或通过多肽 合成仪合成重要抗原表位偶联到载体蛋白上获得。
[0024] 所述检测是定性检测样本中的抗CUZDl抗体，对炎症性肠病进行辅助诊断。所述 样本为血清、血浆、全血或其他体液。
[0025] 本实用新型所用的单克隆抗体用现有技术杂交瘤方法制备或者通过重组DNA法 进行制备。
[0026] 本实用新型所用的多克隆抗体或通过免疫动物来制备。
[0027] 本实用新型所用的⑶ZDl抗原蛋白、SPA、Protein G用基因工程方法获得。
[0028] 本实用新型的检测原理为（以结合垫上的标记蛋白A为⑶ZDl蛋白，B为兔IgG为 例）：
[0029] 胶体金或彩色胶乳标记的蛋白A和蛋白B喷涂于结合垫，分析膜检测带T线上包 被抗人IgG，质控带C线上包被抗兔IgG。当样本随着层析泳动到结合垫并浸润胶体金或胶 乳标记物时，其中的人IgG和标记蛋白A结合形成人IgG-标记蛋白A复合物，由于毛细管效 应，此复合物沿向吸水垫方向泳动，如果样品中含有抗CUZDl抗体，此复合物与包被于检测 带T线上的抗人IgG发生特异性免疫结合反应，形成金标/胶乳蛋白A (CUZDl)-人抗CUZDl IgG抗体-抗人IgG三联体复合物而被截留在检测线上，逐渐富集形成较深的紫红色条带 或胶乳颜色；由于毛细效应继续泳动向前，金标/胶乳兔IgG与包被在质控线上的羊抗兔 IgG发生特异的免疫反应被截留，逐渐富集在质控线上形成较深的紫红色条带或胶乳颜色， 多余的未结合的物质继续层析到吸水垫上，因此在检测线和质控线