脑钠肽免疫层析定量检测试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001]本实用新型属于免疫检测领域，具体涉及一种高灵敏度脑钠肽免疫层析定量检测试纸条。
【背景技术】
[0002]1988年日本学者Tetsuji Sudoh首次从猪脑内分离得到一种具有强力的利钠、利尿、扩血管和降压作用的多肽，命名为脑钠肽(brain natriuretic peptide，BNP)。以后的研究表明，不只是BNP这一种多肽，而是有一组多肽在生物进化的过程中逐渐发展产生(在人类和脊椎动物至少包括ANP、BNP、CNP、DNP、VNP和Urodilatin)，称为利钠肽(NP)家族。其功能是维持循环系统的容量、渗透压和压力调节的稳态。目前用于临床检测的包括BNP和氨基末端脑钠肽前体(NT-proBNP)两种。在心肌细胞受刺激后，产生初始基因产物前BNP前体(pre-proBNP)，该肽的一个26氨基信号肽被立即去除，形成含108个氨基酸的的BNP前体(proBNP)，后者在内切酶的作用下裂解为含有76个氨基酸、无生物活性的NT-proBNP和含有32个氨基酸、有活性的BNP。两者有相同的生物学来源，但生物学效应和临床意义不完全相同。BNP和NT-proBNP检测在本世纪初先后进入我国，十年来已经为各级医院和医师广泛用于临床实践，成为心血管病尤其是心力衰竭诊断十分有用的生物标志物。我国2007年《慢性心力衰竭诊断治疗指南》也推荐将BNP和NT-proBNP用于慢性心衰的诊断和预后判断。
[0003]脑钠肽(BNP)主要来源是心室。在正常状态下，BNP在颗粒中储存很少，机械性刺激是心室产生及分泌BNP的主要原因。当各种心肌损伤引起心输出量下降时，反馈性的兴奋神经、体液机制，从而使血管收缩、水钠潴留、心脏前后负荷增加，心肌张力升高，心肌细胞受到牵拉，使心室肌细胞BNP合成与分泌增加，血浆BNP浓度升高。可以产生抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统、抑制交感神经活动、减少水钠潴留、舒张血管等作用，对心脏有保护作用。因而血浆BNP水平的异常变化即可以显示心脏功能的变化。
[0004]30年间，BNP在心脏疾病领域有了很大的转变，从最初的研究热点到确定为HF的诊断标记物。截止到目前，已经确定了 BNP对于HF的诊断作用，评估预后的功能也开始应用，而钠尿肽的筛查功能和预测HF等级方面还需要进一步确定。
[0005]BNP的测定方法较多，产品多样，定量检测的有:放射免疫法(RIA)，高灵敏度的免疫放射法(IRMA)，酶免疫法(EIA)，微粒子酶免疫法(MEIA)，免疫荧光法(FIA)等。
[0006]1.EIA及RIA法测定BNP时，血浆标本均须经过抽提浓缩10倍以上，需要I毫升以上血浆标本，并且反应时间长达18-24小时，不适于常规操作。且RIA法有放射性污染问题，有一定局限性。IRMA法准确敏感，但亦较为费时费力，须经过温育过夜的实验步骤，自动化程度不高，也存在放射性1125对环境及操作人员的损害。
[0007]2.MEIA采用BNP特异的单克隆抗体和二步夹心分析技术测定血浆BNP水平。样品中的BNP被包被在乳胶微粒子颗粒上的抗-BNP抗体捕获，微粒子在纤维网上进行清洗分离，结合在纤维网上的BNP再与碱性磷酸酶标记的另一株单抗结合。通过对荧光底物磷酸-4-甲基伞型酮催化反应所发出的荧光信号进行检测，和已知浓度的标准物荧光信号强度进行比较，可得到待测样品中BNP浓度。
[0008]各种市售BNP测定试剂盒由于使用的抗原标准品，单抗来源以及抗体所针对的BNP抗原决定簇不同，这些检测方法在灵敏度、特异性等方面存在差异。由于不同实验室对同一份样品的测定值不一致，对判断测定值的临床意义造成了困难。因此，首先应针对各种测定方法建立相应的正常人及各种病理状态下的测定参考值范围。就目前的现状而言，BNP检测方法的标准化还有很长的路要走。
[0009]生物素-亲和素系统(b1tinavidin system，BAS)，是一种新型生物反应放大系统。随着各种生物素衍生物的问世，BAS很快被广泛应用于医学各领域。将该系统应用于免疫组化，酶联免疫，荧光免疫，放射免疫等检测技术中，可显著地提高以上技术方法的敏感性、特异性和稳定性，使方法更简便，有助于临床快速诊断，并利于进行大规模流行病学调查，成为研究免疫反应的有力工具。由于BAS检测系统经济快速，又无放射物质污染，不需复杂仪器，充分显示了此系统的巨大潜力和应用的可能性。
[0010]生物素-亲和素系统检测原理:BAS是在常规ELISA原理的基础上，结合生物素与亲和素间的高度放大作用，而建立的一种检测系统。亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，分子量为68kDa，由4个亚单位组成，对生物素有非常高的亲和力(结合常数高达115M1K生物素很易与蛋白质(如抗体等)以共价键结合。这样，结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而呈色，达到检测未知抗原(或抗体)分子的目的。链霉亲和素是与亲和素有相似生物学特性的一种蛋白质，链霉亲和素与亲和素一样分子中每条肽链都能结合一个生物素，因几乎所有用于标记的物质均可以同亲和素或链霉亲合素结合。利用生物素-亲和素系统研制脑钠肽检测快速诊断试剂尚无报道。
【实用新型内容】
[0011]本实用新型的目的，在于提供一种脑钠肽免疫层析定量检测试纸条，其基于双抗体夹心法、荧光免疫侧向层析和生物素-链霉亲和素放大系统，提供高灵敏度脑钠肽免疫层析定量检测试纸条。使用本实用新型时，提高了检测灵敏度和检测稳定性，降低了非特异性结合，检测时间不大于10分钟，大大提高了诊断效率。
[0012]本实用新型解决其技术问题的解决方案是:脑钠肽免疫层析定量检测试纸条，其包括底板，所述底板上依次设有样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述吸水垫和荧光标记物结合垫分别交叠压在硝酸纤维素膜的两端后在硝酸纤维素膜的表面形成检测区，所述样品垫交叠压在荧光标记物结合垫上，所述荧光标记物结合垫上固定有生物素标记的脑钠肽单克隆抗体和链霉亲和素标记的荧光蛋白；所述检测区内的硝酸纤维素膜上固定有识别脑钠肽另外一个表位的单克隆抗体构成的检测线和羊抗鼠IgG多克隆抗体构成的质控线。
[0013]作为上述技术方案的进一步改进，所述荧光标记物结合垫包括层叠的第一荧光标记物结合垫和第二荧光标记物结合垫，所述第一荧光标记物结合垫的一端垫在样品垫的下方，所述第二荧光标记物结合垫交叠压在硝酸纤维素膜的一端。
[0014]作为上述技术方案的进一步改进，所述第一荧光标记物结合垫中插入样品垫下方的一端设有定位条，所述样品垫的下端面设有能容纳定位条的定位槽。
[0015]作为上述技术方案的进一步改进，还包括卡壳，所述底板、样品垫、荧光标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫均置于卡壳内，所述卡壳壳面上对应于硝酸纤维膜的位置设有观察窗，卡壳壳面上对应于样品垫的位置设有加样孔。
[0016]作为上述技术方案的进一步改进，所述观察窗为长方形孔。
[0017]作为上述技术方案的进一步改进，所述荧光蛋白可以是绿色荧光蛋白、藻胆蛋白中的一种。
[0018]作为上述技术方案的进一步改进，所述样品垫为经表面活性剂缓冲液浸泡处理后干燥的玻璃纤维构件。
[0019]作为上述技术方案的进一步改进，所述底板为聚苯乙烯构件或者聚乙烯构件。
[0020]作为上述技术方案的进一步改进，所述卡壳包括塑料上壳和塑料下壳，所述塑料上壳扣合塑料下壳上后形成卡壳。
[0021]本实用新型与现有技术相比，具有如下优点:
[0022](I)本实用新型将荧光蛋白作为标记物，此标记物稳定性良好，有利于提高检测稳定性。
[0023](2)本实用新型通过利用“链霉亲和素-生物素放大系统”，提高检测灵敏度，降低非特异性结合，有利于提高试剂盒性能。
[0024](3)利用本实用新型进行脑钠肽的检测时间不大于10分钟，检测线性范围为5.0-5000.0pg/mL，极大地提高了检测效率。
[0025](4)本实用新型可通过荧光免疫分析仪对结果进行判读，可实现自动化，减少主观因素的影响，提供便利、快速、可靠的诊断结果。
[0026](5)本实用新型卡壳设有样品进入的加样孔和供观测结果的观察窗，根据分析仪器判定结果，准确可靠。