一种DNA分子的定点编辑方法与流程

本发明涉及一种采用电场调节装置和AFM系统实现DNA分子拉伸、拉直及定点切割的方法，属于生物大分子纳米操纵技术领域。

背景技术：

自20世纪后期以来，随着科学技术的长足进步与发展，对于自然的探索，人类开始由对外界的认知转向其自身转变，生命科学受到人们越来越多的关注并占据着举足轻重的地位。与此同时，生命科学领域内取得了卓越的进步与发展：DNA分子双螺旋结构的发现与研究、克隆技术的突破、转基因技术的成功、基因重组及嫁接技术的探索等。生命科学与我们的生活息息相关，并很大程度上促进了工业、农业、环境保护以及医学等领域的发展。以人类基因组计划为代表，全球范围内对此投入了越来越多的人力、物力和财力。步入21世纪，生命科学的研究已经开始向单细胞单分子层次发展。目前，许多科技工作者已经从生物单分子范畴着力对生命活动的过程、疾病的治疗以及药物作用机理等进行研究与探索。

在生物大分子中，DNA分子因包含有生物的遗传信息而备受关注，成为生物分子学中的重要研究对象。自1953年DNA分子的双螺旋构造被提出以来，它的种种性质一直都是各领域科研人员的重点研究目标。由于DNA分子在大多数情况下都是卷曲状态，并且是无规则的，因此宏观或微观条件下都很难观察其细微结构，同时，每条DNA分子链上碱基对的数目也会有许多差异，排列次序也呈现多样化，从而表现出的遗传信息会有所不同。

伴随着纳米电子学、材料科学、生物医学及生物分子学的迅速发展，我们可以采用新的技术工具来分析DNA分子的序列信息，从而实现对DNA分子序列进行定点编辑的目的，完成对生命活动信息的监测等。采用机器人纳米操纵技术对DNA分子进行研究，除了有利于对单分子序列信息的探索，还可以通过特定力的拉伸来探究DNA分子折叠结构力学及基因编辑等信息。总之，采用微纳操纵技术来完成对DNA分子的操纵，对于在纳米层次上直接探究生物分子的作用、展现各类重要生命活动的本质、完成DNA分子编辑、促进新型特性化医疗器械的研发和各种疾病的治疗等都具有重大而深远的意义。

目前，用于DNA分子的定点编辑方法通常都是采用生物学基因打靶技术实现，容易引入额外的突变基因，且编辑效率比较低。本发明克服了这一缺点，精准定位基因位点，将DNA分子拉伸，避免了DNA分子链上其它位点的干扰，针对性强，操作过程简便。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种电场力操纵DNA分子实现其拉伸、拉直及定点切割的方法。本发明采用直流电源通过电压增进式给装置充电，利用电场力拉伸DNA分子，通过AFM系统检测DNA分子的拉伸情况，选择单个DNA分子为待操纵目标，采用恒力和酶切割两种方式实现DNA分子的定点切割。本发明属于生物大分子纳米操纵技术领域，提供了一种低成本、简洁、高效的DNA操纵技术方法。

本发明方法通过如下技术方案实现：采用静电场电荷相互作用，载玻片作为调控装置的中间介质，铜胶带作为装置电极板，并在装置上下两表面分别引出一条导线用于与直流电源相连；DNA分子溶液用TE缓冲液稀释至一定浓度作为实验DNA溶液，采用新鲜剥离的氟晶云母片作为基底，将氟晶云母片置于电场调控装置上极板的中间位置，设定所需电压值至装置充电完成，将配置好的DNA溶液滴到云母片上。然后采用电压增进式对装置进行充电，将每个电压值下拉伸的DNA分子样品置于原子力显微镜(AFM)系统下成像，直至在云母片上得到具有拉直的并且分散有序的DNA分子图像，随后选择单根DNA分子并分别采用恒力切割和酶切割两种方法对DNA分子进行定点切割。本发明利用DNA分子具有微弱负电性的特性，与调控装置表面的正电荷具有异性相吸的作用来操纵DNA分子，使其呈现出有序的平行序列。恒力切割是通过对AFM系统针尖施加一定大小的力，并让其划过DNA分子的特定碱基来实现DNA分子的定点切割；采用酶切割是利用限制性内切酶在Mg²⁺存在的条件下可以剪切DNA分子任意位点这一性质，将带有酶溶液的针尖置于准备切割的位点，完成定点切割。在DNA分子拉直过程中应用静电场的作用，设备简单，过程简洁快速，制备成本低，DNA分子无需钝化处理过程，不使用有毒化学溶剂，所制备的DNA分子平行序列重现性好，易于切割，并且具有良好的稳定性；切割过程中，采用恒力和酶切割，方法简便快捷，碱基针对性强，效率高。

如图1所示，本发明具体包括以下步骤：

(1)DNA分子溶液的配置：取1.0～2.0μL的原浓度为0.25～0.6μg/μL的DNA分子溶液，48.0～49.0μL的TE缓冲液，将两溶液混合，置于离心管中采用振荡器振荡，得到稀释均匀的DNA分子溶液，密封待用；

(2)密封待用；第二步，云母衬底预处理：将云母衬底分别用去离子水、无水乙醇超声清洗60～120s(超声频率为42000Hz)，取出后自然干燥；用透明胶带剥离云母衬底，得到完整的一层，密封待用；

(3)电场调控装置的制作：将表面积为0.5cm×1.5cm～1.0cm×3.0cm、厚度为0.1mm～0.3mm的载玻片作为调控装置的电介质，分别置于去离子水、无水乙醇中超声清洗3～5次，每次60～120s，取出后干燥；将表面积为0.5cm×1.5cm～1.0cm×3.0cm、厚度为0.01～0.05mm的导电金属片平铺覆盖于载玻片的上、下两个表面作为电场调控装置的上、下两极板，分别置于去离子水、无水乙醇中超声清洗3～5次，每次60～120s，取出后干燥，制成电场调控装置；

(4)拉直：将步骤(3)中所制得的调控装置的上、下两极板通过导线分别与直流电源的正、负极相连，将步骤(2)剥离后的云母衬底置于调控装置的中间位置，调节电源电压值使其由0V～0.2V以0.025V为间隔依次增加，待装置充电完成，将步骤(1)中稀释均匀的DNA分子溶液分别滴至不同电压值下的云母衬底表面，得到DNA分子样品；

(5)成像：将DNA分子样品置于AFM系统样品台上，系统设置为Imaging工作模式，设置各扫描参数，Line Rate：1.000Hz；Setpoint：0.3V；IGain：30.0Hz；PGain：0.0010，成像，得到DNA分子扫描图像。

(6)定点切割：在步骤(5)中得到的DNA分子扫描图像中选择一根单独被拉伸的DNA分子作为切割目标，然后采用恒力定点切割或酶定点切割方法对目标DNA分子进行定点切割，最终完成DNA分的定点编辑。

如图2所示，恒力切割过程：

(1)将AFM系统的Imaging模式切换成Manipulation模式，选取目标DNA分子的待切割位点，规划切割路径；

(2)精确定位探针及DNA分子的相对位置，针尖下移，设置各切割参数值，V：0.5μm/s；Setpoint：1.0～1.5V；IGain：150Hz；PGain：0.0048，通过纳米位移平台控制探针的移动，按步骤(1)中规划的路径对DNA分子进行定点切割，切割完毕抬针；

(3)将AFM系统的Manipulation模式重新切换成Imaging模式，在该模式下，下针，设置各扫描参数，Line Rate：1.000Hz；Setpoint：0.3V；IGain：30.0Hz；PGain：0.0010，重新扫描该区域，根据扫描图像判断是否成功实现DNA分子的定点切割；

(4)如若没有成功，则继续从步骤(1)开始，直至实现DNA分子定点切割。

如图3所示，酶切割过程：

(1)在所选DNA分子位置的边缘滴加稀释浓度范围为0.05～0.15unit/μL的DNase I溶液，控制针尖移动至DNase I溶液的上方位置，下针，使针尖上粘有酶溶液。

(2)抬针，然后将针尖移至DNA分子图像切割位点的上方，下针，利用针尖上的酶对DNA分子进行切割，抬针。

(3)将针尖移动至原DNA分子图像的上方，下针，设置各扫描参数为：Line Rate：1.000Hz；Setpoint：0.3V；IGain：30.0Hz；PGain：0.0010，重新扫描原DNA分子区域，根据扫描图像判断是否成功实现DNA分子的定点切割；

(4)如若没有成功，则继续从步骤(1)开始，直至实现DNA分子的定点切割。

实验过程中，直流电源电压值以由0V开始，依次增大0.025V逐次对装置进行充电。

所述电场调控装置中的载玻片、导电金属片均采用去离子水、无水乙醇进行超声清洗并高温干燥，并将场调控装置的上、下表面分别与直流电源的正、负极相连。

所述云母衬底为氟晶云母片，杂质吸附少，平整度高，是天然云母的数十倍。

所述的DNA溶液为λ噬菌体DNA溶液，浓度为500ng/μL，高浓度DNA容易粘连。采用TE缓冲液将其稀释至浓度为10ng/μL。

所述的DNA呈微弱的负电性。

所述的AFM系统，原子级分辨率：x、y方向精确到0.2nm，z方向精确到0.02nm。

所述的酶溶液，浓度为50unit/μL，高浓度的酶溶液会对切割位点的识别造成干扰，采用其存储液将其稀释至浓度范围为0.05～0.15unit/μL。

所述的酶存储液由50mM Tris溶液、10mM CaCl₂溶液(PH＝7.5)与glycerol溶液体积比1:1配置而成。

本发明运用电场调节装置和AFM操纵DNA分子，实现其拉伸、拉直及定点切割，克服了现有技术的不足，提供了一种低成本、简单、快速、高效的DNA分子定点切割技术，以促进生物纳米操纵技术的发展。本发明与现有方法相比有以下优点：

(1)采用电场调控装置操纵DNA分子，设备简单；

(2)制备成本低廉、原料易得；

(3)实验条件简单常用，仅在实验室内完成，获得的DNA分子拉直图像效率高、重现性好；

(4)DNA分子拉伸、拉直过程中的电场力大小通过直流电源来控制，简单方便。

(5)DNA分子成像及操纵衬底采用人工氟晶云母，平整度高，是天然云母的数十倍。

(6)拉直后的DNA分子更容易采用恒力切割和酶切割，避免了DNA分子处于弯曲状态下的干扰。

附图说明

图1为本发明中DNA分子拉伸、拉直流程图；

图2为本发明中DNA分子恒力定点切割流程图；

图3为本发明中DNA分子酶定点切割流程图；

图4为本发明制作的电场调控装置图，其中1为铜片，2为云母衬底，3为DNA分子溶液；

图5为本发明DNA分子形态随电源电压值大小的变化图，其中(a)到(h)分别为电源电压值在0.025V、0.050V、0.075V、0.10V、0.125V、0.150V、0.175V、0.200V下的DNA分子拉伸情况；

图6为DNA分子恒力定点切割前后图，其中(a)为切割前图像，(b)为切割后图像；

图7为DNA分子酶定点切割前后图，其中(a)为切割前图像，(b)为切割后图像。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例详细介绍本发明。但以下的实施例仅限于解释本发明，本发明的保护范围应包括权利要求的全部内容，不仅仅限于本实施例。

本发明实施例中使用的DNA分子溶液为λ噬菌体DNA溶液，长度约15.6μm；切割酶溶液浓度为0.15unit/μL；云母衬底规格大小为1cm×1cm；成像及切割探针型号为DNP-10，没有经过修饰或其它特殊处理。首先采用自制的电场调控装置实现DNA分子的拉伸、拉直，然后再用JPK原子力显微镜系统分别采用恒力切割和酶切割两种方式进行定点切割。

实施例1

如图4为本发明制作的电场调控装置，包括铜片1，云母衬底2，DNA分子溶液3：将铜片平铺于电场调控装置表面，待电场调控装置充电完成，将云母衬底2置于整个电场调控装置的中间位置，随后将DNA分子溶液滴到云母衬底2的表面。

具体的DNA分子拉伸步骤如下：

(1)DNA分子溶液的配置：用移液器分别取1μL浓度为500ng/μL的原DNA分子溶液，49μL的TE缓冲液置于离心管中，将两溶液混合，采用振荡器振荡(振荡频率50Hz)得到稀释均匀的DNA分子溶液，密封待用；

(2)云母衬底预处理：将云母衬底分别用去离子水、无水乙醇超声清洗3次，每次120s(超声频率为42000Hz)，取出后自然干燥；用透明胶带剥离云母衬底，得到完整的一层，密封待用；

(3)电场调控装置的制作：将表面积为1cm×3cm、厚度为0.2mm的载玻片作为调控装置的电介质，分别置于去离子水、无水乙醇中超声清洗3次，每次120s超声频率为42000Hz)，取出后高温干燥；将表面积为1cm×3cm、厚度为0.01mm的铜片平铺覆盖于载玻片的上下两个表面作为电调控装置的上下两极板，分别置于去离子水、无水乙醇中超声清洗3次，每次120s，取出后干燥；

(4)拉直：将步骤(3)中所制得的电调控装置上、下两极板通过导线分别与直流电源的正、负电极相连，将步骤(2)剥离后的云母衬底置于电调控装置的中间位置，调节电源电压值为0.025V，待电调控装置充电完成，吸取步骤(1)中稀释均匀的DNA分子溶液2μL滴至云母衬底表面；此外，还将电压值分别置为0.050V、0.075V、0.10V、0.125V、0.150V、0.175V、0.200V，采用同样方式处理样品。

(5)成像：将DNA样品置于AFM系统样品台上，设置为Imaging工作模式，设置各扫描参数，Line Rate：1.000Hz；Setpoint：0.3V；IGain：30.0Hz；PGain：0.0010，得到如图5中(a)至(h)所示的DNA分子扫描图像，由图像可以说明DNA分子的形状随着电压值的逐渐增大而逐渐由凌乱状态变成有序的平行序列。当电压值达到0.175V时，所提供的电场强度大小足以实现DNA分子的拉伸，并且使其呈现出规则的平行序列。

实施例2

图6和图7分别为本发明所述的恒力切割和酶切割两种DNA分子定点切割方式下的切割图像。具体步骤分别为：

恒力切割：

(1)将AFM系统的Imaging模式切换成Manipulation模式，选取如图6(a)中的目标DNA分子的待切割位点，规划切割路径；

(2)精确定位探针及DNA分子的相对位置，针尖下移，设置各切割参数值，V：0.5μm/s；Setpoint：1.5V；IGain：150Hz；PGain：0.0048，通过纳米位移平台控制探针的移动，按步骤(1)中规划好的路径对DNA分子进行定点切割，切割完毕抬针；

(3)将AFM系统的Manipulation模式重新切换成Imaging模式，在该模式下，下针，调节各扫描参数，Line Rate：1.000Hz；Setpoint：0.3V；IGain：30.0Hz；PGain：0.0010，重新扫描该区域，得到如图6中的(b)所示的DNA分子恒力定点切割图。

对比图6中(a)和(b)两图可以说明在发明采用的DNA分子拉伸方法DNA分子与云母衬底表面的粘附力不大，在此基础上运用AFM系统恒力切割很容易实现DNA分子的定点切割，并且切割方法简单，不受其它DNA分子的影响，位点精确，易于实现。

酶切割：

(1)在所选如图7(a)中的DNA分子边缘位置滴加稀释浓度为0.10unit/μL的DNase I溶液，控制针尖移动至DNase I溶液的上方位置，下针，使针尖上粘有酶溶液。

(2)抬针，然后将针尖移至DNA分子图像切割位点的上方，下针，利用针尖上的酶对DNA分子进行切割，抬针。

(3)将针尖移动至原DNA分子图像的上方，下针，设置各扫描参数，Line Rate：1.000Hz；Setpoint：0.3V；IGain：30.0Hz；PGain：0.0010，重新扫描原DNA分子区域，得到如图7(b)所示的DNA分子酶定点切割图。

对比图7中(a)和(b)两图可以说明本发明运用AFM系统采用酶切割也很容易实现DNA分子的定点切割。该方法采用生物学方法实现DNA分子的定点切割，使其保持原性质不发生改变，不会造成污染。

需要说明的是，按照本发明上述各实施例，本领域技术人员是完全可以实现本发明独立权利要求及从属权利的全部范围的，实现过程及方法同上述各实施例；且本发明未详细阐述部分属于本领域公知技术。

以上所述，仅为本发明部分具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。