雷诺丁受体调控心肌细胞中Ca2+波的二维建模方法与流程

本发明涉及一种雷诺丁受体调控心肌细胞中Ca²⁺波的二维建模方法。

背景技术：

基于簇状雷诺丁受体的Ca²⁺火花是正常心肌细胞内的基本Ca²⁺释放事件，能够在一定的病理条件下发生沿长度方向的自传播序列，这使得Ca²⁺浓度升高。因此，我们在细胞的多样性中观察Ca²⁺波，进而在实验和理论上研究。在心肌细胞中产生Ca²⁺波与簇状的雷诺丁受体和肌浆网终池上的Ca²⁺超载有关。Ca²⁺夸克由游离的雷诺丁受体引起，具有小振幅，长释放时间的特点，是另一个重要的Ca²⁺释放机制。因此，Ca²⁺波是Ca²⁺火花和夸克共同作用的结果。

然而，目前缺乏Ca²⁺波与Ca²⁺火花和Ca²⁺夸克的相互作用之间的联系的相关研究。基于细胞质中Ca²⁺的菲克扩散理论，现有技术建立一个能够显示游离雷诺丁受体对心脏衰竭下Ca²⁺波的影响的计算模型。但是，仍然很难用菲克扩散模型解释火花-宽度的悖论。最近，Izu等人指出，不规则的扩散模型可以解释火花-宽度悖论，从而更深入地研究了Ca²⁺的扩散机理。而在复杂的环境中(如细胞质中)，所有的分子和离子都是这样的。

另一方面，建立Ca²⁺波模型的一个挑战是：关于细胞质内自由Ca²⁺的浓度的计算与实验的不一致性([Ca²⁺]cyto)。生理条件下[Ca²⁺]cyto的计算结果大约是20μM，在病理情况下甚至高达100μM，这与计算[Ca²⁺]cyto为1μM的结果不一致。而“波前敏化”模式允许Ca²⁺波的传播振幅为1μM，但是Ca²⁺波的传播机理仍不清楚。Sobie等人回顾了心脏肌浆网终池Ca²⁺调控的重要性，并指出提高肌浆网终池Ca²⁺水平可以提高雷诺丁受体的激发概率。因此，在Ca²⁺波的计算模型中，我们应该将肌浆网终池的Ca²⁺准则引入到Ca²⁺波的计算模型中，通过利用游离和簇状的雷诺丁受体作为肌浆网终池损耗，以此来显示Ca²⁺通量的减少。

技术实现要素：

本发明目的是：提供一种雷诺丁受体调控心肌细胞中Ca²⁺波的二维建模方法，采用该方法建立的Ca²⁺波的二维模型用以研究游离和簇状的雷诺丁受体的相互作用对调节Ca²⁺波的影响。

本发明的技术方案是：一种雷诺丁受体调控心肌细胞中Ca²⁺波的二维建模方法，包括如下步骤：

步骤S1：建立细胞质的钙离子扩散模型：

其中[Ca²⁺]cyto为细胞质中自由Ca²⁺的浓度，t为扩散时间，x和y为Ca²⁺空间坐标，Dx和Dy分别为各向异性的Ca²⁺扩散系数，β为反常扩散阶数；Jdye为细胞质中Ca²⁺荧光指示剂染料的流量；Jbuffer-cyto为与细胞质中缓冲剂结合的Ca²⁺流量；Jpump为肌浆网泵中Ca²⁺-ATP酶的抽运速率，Jclustered为由簇状的雷诺丁受体释放的Ca²⁺流量，Jrogue为由游离的雷诺丁受体释放的Ca²⁺流量；

步骤S2：建立肌浆网终池中的Ca²⁺空穴模型：

其中[Ca²⁺]lumen为肌浆网终池腔内自由Ca²⁺的浓度；Jrelease-lumen为在肌浆网终池中激发簇状雷诺丁受体和游离雷诺丁受体后，Ca²⁺释放产生的流量；Jbuffer-lumen为由于肌集钙蛋白的缓冲作用，在肌浆网终池腔内的Ca²⁺流量；Jrefill为再次填充的Ca²⁺流量；

步骤S3：建立激发游离和簇状的雷诺丁受体的概率模型：

Pfiring＝Pcyto·Φlumen(3)；

其中Pfiring为激发游离和簇状的雷诺丁受体的概率，Pcyto为在单位时间内，由[Ca²⁺]cyto决定的钙释放事件的激发概率；Φlumen为肌浆网终池中Ca²⁺的钙释放事件的调控项；

步骤S4：模拟来自多个释放位置的Ca²⁺释放事件，并建立2D计算域模型：

其中α＝β-1；k为在α<k<α+1范围内的整数；h为最大网格尺寸；Γ为Gamma函数。

作为优选的技术方案，在步骤S1中：

其中n为细胞质中缓冲剂的种数，h表示希尔常数；[F]T和[B]T分别为指示剂和缓冲区的初始Ca²⁺浓度；[CaF]和[CaBn]为Ca²⁺结合物的浓度；和为反应动力学参数；Kpump为亲和性常数，为肌浆网泵的最高速率。

作为优选的技术方案，在步骤S1中：

δ为狄拉克函数，S为激发钙释放单元开始的一个随机函数，和分别为二维平面上游离和簇状的雷诺丁受体的位置，Trogue和Tclustered分别为游离和簇状的雷诺丁受体的释放时间，σrogue和σclustered分别为游离和簇状的雷诺丁受体的等源强度。

作为优选的技术方案，在步骤S1中：

σrogue＝0.64Irogue([Ca²⁺]lumen-[Ca²⁺]cyto)/2F (1.6)；

σclustered＝0.64Iclustered([Ca²⁺]lumen-[Ca²⁺]cyto)/2F (1.7)；

其中F为法拉第常数，Irogue和Iclustered分别为通过游离和簇状的雷诺丁受体的平均电流。

作为优选的技术方案，在步骤S2中：

Jrefill＝([Ca²⁺]NSR-[Ca²⁺]lumen)/τrefill (2.1)；

其中[Ca²⁺]NSR为在网状肌浆网中的自由Ca²⁺浓度；τrefill为对于在肌浆网终池和网状肌浆网之间的Ca²⁺转换的时间常数。

作为优选的技术方案，在步骤S3中：

Φlumen＝φ^m (3.2)；

其中PRyR是指每个雷诺丁受体通道的单位时间内的激发概率，φ为肌浆网终池中Ca²⁺对单个雷诺丁受体的调控项，m为游离或簇状雷诺丁受体的调控系数，nRyR为雷诺丁受体的个数。

本发明的优点是：在心肌细胞内，量化游离和簇状的雷诺丁受体在调节Ca²⁺波中的相互作用。在考虑到肌浆网终池膜上分布的簇状和游离的雷诺丁受体，提出一种细胞质中Ca²⁺波的二维模型及其建模方法。同时模型中还包括了在细胞质中Ca²⁺和肌浆网终池Ca²⁺调控中异常的子扩散；游离和簇状雷诺丁受体的Ca²⁺随机释放单元(CRUs)，受到心肌细胞的细胞质和肌浆网终池腔中自由Ca²⁺的浓度的调控；通过这些特征，证明了游离的雷诺丁受体对Ca²⁺波开始和传播的重要性。

本发明对心肌细胞中Ca²⁺波的心脏疾病有一定的影响，根据模型模拟，[Ca²⁺]lumen能够调节Ca²⁺的波动特性，在Ca²⁺不诱导释放机制的情况下，肌浆网终池Ca²⁺的超载可以提高RyR的激发概率，并在心脏中产生Ca²⁺波形；另一方面，雷诺丁受体中的突变可能引发室性心动过速和心脏性猝死。

而Ca²⁺波的振幅和速度也受到游离雷诺丁受体参数的显著影响，这可能是导致纤维性颤动和心律失常的危险因素，例如，在减少CRUs的数量后，游离雷诺丁受体的平均电流和释放时间可能会抑制Ca²⁺波或充血性心力衰竭的肌细胞内Ca²⁺的瞬变，因此，通过游离雷诺丁受体抑制Ca²⁺夸克，可能是治疗心力衰竭的理想治疗方式。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1a为心肌细胞的二维示意图；

图1b和1c为在肌浆网终池上的钙释放单元(CRUs)分布示意图；

图2a为钙火花激发游离雷诺丁受体的示意图；

图2b为钙火花激发簇状雷诺丁受体的示意图；

图2c为在游离雷诺丁受体的帮助下，钙火花激发簇状雷诺丁受体的示意图；

图3a为钙火花激发概率的数量函数示意图；

图3b为100ms时激发钙火花的数量示意图；

图4a为Ca²⁺波在雷诺丁受体影响下的二维示意图；

图4b为Ca²⁺波在没有雷诺丁受体影响下的二维示意图；

图4c为Ca²⁺波的线扫描图；

图5a为在不同的[Ca²⁺]lumen下Ca²⁺波的线扫描图；

图5b为在不同的[Ca²⁺]lumen下Ca²⁺波的速度变化图；

图5c为在不同的[Ca²⁺]lumen下Ca²⁺波的振幅变化图；

图6a为在不同的游离雷诺丁受体个数的钙波线扫描图；

图6b为在不同的游离雷诺丁受体个数下，钙波的速度和振幅变化图；

图7为钙释放单元(CRUs)之间的距离对钙波的振幅和速度变化示意图。

具体实施方式

实施例1：考虑到细胞质中Ca²⁺的准各向同性扩散，采用二维模型模拟Ca²⁺波，如图1a为心肌细胞的二维示意图，心肌细胞的纵轴是指在z轴上的x方向和y方向。肌浆网终池(黄点)均匀的沿着x轴lx(2μm)和沿轴ly(0.8μm)分布。图1b和1c说明了肌浆网终池的原理，并展示了在肌浆网终池上的CRUs分布，其中包括随机分布的簇状雷诺丁受体(～22雷诺丁受体通道)的CRUs和游离的雷诺丁受体(～3雷诺丁受体通道)的CRUs。簇状雷诺丁受体(蓝点，在肌浆网终池中～2CRUs)的CRUs被随机分布的游离的雷诺丁受体(红点，在肌浆网终池中～8CRUs)包围。在模拟计算中，钙释放单元(CRUs)的数量和位置是随机的。

本发明的雷诺丁受体调控心肌细胞中Ca²⁺波的二维建模方法，包括如下步骤：

步骤S1：建立细胞质的钙离子扩散模型：

其中[Ca²⁺]cyto为细胞质中自由Ca²⁺的浓度，t为扩散时间，x和y为Ca²⁺空间坐标，Dx(＝300μm²s^-1)和Dy(＝150μm²s^-1)分别为各向异性的Ca²⁺扩散系数，β(＝2.25)为反常扩散阶数；Jdye为细胞质中Ca²⁺荧光指示剂染料Fluo-4-AM的流量；Jbuffer-cyto为与细胞质中缓冲剂结合的Ca²⁺流量；Jpump为肌浆网泵中Ca²⁺-ATP酶的抽运速率，Jclustered为由簇状的雷诺丁受体释放的Ca²⁺流量，Jrogue为由游离的雷诺丁受体释放的Ca²⁺流量，在[Ca²⁺]cyto超过了静息Ca²⁺浓度水平(细胞质中的静息Ca²⁺的浓度水平是0.1μM)时，肌浆网泵开始启动；

上述变量都可以定义为:

其中n为细胞质中缓冲剂的种数，h表示希尔常数；[F]T和[B]T分别为指示剂和缓冲区的初始Ca²⁺浓度；[CaF]和[CaBn]为Ca²⁺结合物的浓度；和为反应动力学参数；Kpump为亲和性常数，为肌浆网泵的最高速率；

δ为狄拉克函数，S为激发钙释放单元开始的一个随机函数，和分别为二维平面上游离和簇状的雷诺丁受体的位置，Trogue＝20ms和Tclustered＝10ms分别为游离和簇状的雷诺丁受体的释放时间，σrogue和σclustered分别为游离和簇状的雷诺丁受体的等效强度；

σrogue＝0.64Irogue([Ca²⁺]lumen-[Ca²⁺]cyto)/2F (1.6)；

σclustered＝0.64Iclustered([Ca²⁺]lumen-[Ca²⁺]cyto)/2F (1.7)；

其中F(＝96500C·mol^-1)为法拉第常数，Irogue和Iclustered分别为通过游离和簇状的雷诺丁受体的平均电流，一般来说，在正常生理条件下，Ca²⁺波的电流比正常的电流要大，所以Irogue和Iclustered被设置为0.15pA/mM，1.5pA/mM，大约是CRUs的正常生理电流的两倍(0.07pA/mM，0.7pA/mM)。。

步骤S2：建立肌浆网终池中的Ca²⁺空穴模型：

其中[Ca²⁺]lumen为肌浆网终池腔内自由Ca²⁺的浓度；Jrelease-lumen为在肌浆网终池中激发簇状雷诺丁受体和游离雷诺丁受体后，Ca²⁺释放产生的流量；Jbuffer-lumen为由于肌集钙蛋白的缓冲作用，在肌浆网终池腔内的Ca²⁺流量；Jrefill为再次填充的Ca²⁺流量；

上述变量都可以定义为:

Jrefill＝([Ca²⁺]NSR-[Ca²⁺]lumen)/τrefill (2.1)；

其中[Ca²⁺]NSR＝1.0mM，为在网状肌浆网中的自由Ca²⁺浓度；τrefill＝10ms，为对于在肌浆网终池和网状肌浆网之间的Ca²⁺转换的时间常数，肌浆网终池腔的体积是1×10^-11μL，[Ca²⁺]lumen的起始水平是1.0mM，其中在表1中列举了细胞质和肌浆网终池腔中，染色剂和缓冲区的各种参数。

表1为染料和缓冲区的标准参数值：

步骤S3：建立激发游离和簇状的雷诺丁受体的概率模型：

Pfiring＝Pcyto·Φlumen (3)；

其中Pfiring为激发游离和簇状的雷诺丁受体的概率，Pcyto为在单位时间内，由[Ca²⁺]cyto决定的钙释放事件的激发概率；Φlumen为肌浆网终池中Ca²⁺的钙释放事件的调控项；

上述变量都可以定义为:

Φlumen＝φ^m (3.2)；

其中PRyR是指每个雷诺丁受体通道的单位时间内的激发概率，φ为肌浆网终池中Ca²⁺对单个雷诺丁受体的调控项，即在Walker等人的模型中的实证幂函数，m为游离(m＝1)或簇状(m＝10)雷诺丁受体的调控系数，nRyR为雷诺丁受体的个数。

步骤S4：模拟来自多个释放位置的Ca²⁺释放事件(网格大小为0.1μm、20×20μm大小的)，并建立2D计算域模型，即针对公式(1)的分数微分项，采用格伦沃尔德式中心差分公式离散化计算域：

其中α＝β-1＝1.25；k为在α<k<α+1范围内的整数；h为最大网格尺寸；Γ为Gamma函数，心肌细胞中的自由Ca²⁺浓度和肌浆网终池被同时计算。利用该变量时间步长算法，同时在Monte Carlo仿真中采用了零通量边界条件。

在相邻的肌浆网终池中，游离和簇状雷诺丁受体之间的相互作用：针对Ca²⁺火花是否可以激发邻近肌浆网终池中的游离和簇状的雷诺丁受体，做了一系列研究。同时在二维计算域模型20×20μm²中，针对Ca²⁺释放分别拍摄10、20和40毫秒的簇状雷诺丁受体的CRUs。如图2a、图2b、图2c所示，在游离雷诺丁受体的帮助下，簇状雷诺丁受体的释放可以激发邻近肌浆网终池中簇状雷诺丁受体的其他CRUs。结果表明，这种激活作用可以增加[Ca²⁺]cyto。

Ca²⁺波的起始与传播：当[Ca²⁺]cyto高于静息Ca²⁺浓度水平时，Ca²⁺波可以在此区域触发。此外，具有大电流或多个相邻火花的Ca²⁺火花，也可以触发Ca²⁺波。在这里，此时Ca²⁺波的最低传播速度大约是40-110μm/s。由于在细胞质中Ca²⁺夸克能够增加Ca²⁺的浓度，从而提高了诱导Ca²⁺波在肌细胞中发生的可能性。此外，单个Ca²⁺火花不能形成Ca²⁺波，而在游离雷诺丁受体的帮助下，四个相邻Ca²⁺火花能够保证Ca²⁺波的形成。据图4A和4B的比较说明，当将游离雷诺丁受体的影响考虑到计算模型中时，Ca²⁺波会具有更快的传播速度和更高的振幅。另一方面，在Ca²⁺波进化机制的背后，发现了“火花-扩散-夸克-火花”模式的基本原理。Ca²⁺从簇状的雷诺丁受体扩散到相邻肌浆网终池的过程中，游离的雷诺丁受体随机激活Ca²⁺夸克，然后使簇状的雷诺丁受体激活产生Ca²⁺火花。在下一个z轴上，细胞质中的CRUs将重复这个释放Ca²⁺的过程。游离雷诺丁受体通过激发更多的Ca²⁺火花，加速了波的传播。纵向传播速度的均值为95.9±8.0μm/s,与实验记录(通常100μm/s)相符。此外,在计算模拟中，钙离子浓度的范围为0.1-3.8μM。

图5a表示Ca²⁺波的局部变化；图5b表示随着[Ca²⁺]lumen的增加，Ca²⁺波的速度呈指数级增长；图5c为由于Ca²⁺火花和夸克的大驱动力([Ca²⁺]lumen-[Ca²⁺]cyto)，Ca²⁺波的振幅随[Ca²⁺]lumen呈现线性增加。

游离的雷诺丁受体参数的影响：在聚类的雷诺丁受体附近有大量随机分布的游离雷诺丁受体，对肌浆网终池中Ca²⁺波的灵敏度进行了分析(与游离雷诺丁受体的数量变化相关)。游离雷诺丁受体的每个CRUs释放的Ca²⁺主要由当前游离的雷诺丁受体(Irogue)和当前电流的持续时间(Trogue)决定。当在0.15pA的电流下，游离雷诺丁受体的释放时间每10ms时减小一半，那么相应波动的纵向速度和振幅也随之减小。在持续时间为20ms时，这时电流从0.15pA增加到0.3pA，且Ca²⁺波具有较高的振幅和纵向速度值。因此,一定释放数量的游离雷诺丁受体特征(Irogue×Trogue)是一个重要的波属性影响参数。

表2为Ca²⁺释放对Ca²⁺波特性的影响：

在肌浆网终池中随机包含10-100雷诺丁受体,且平均数量大约为21.6。图7显示了在0.05～0.2μm的范围内的CRUs之间的距离，对Ca²⁺波的振幅的大小有轻微影响。然而,纵向速度是与0.05和0.2μm的距离有关的144.3±13.1μm/s，以及63.6±7.8μm/s。因此，在Ca²⁺波的传播过程中，应该考虑到游离雷诺丁受体和簇状雷诺丁受体的CRUs之间的距离。

在细胞质中建立了一个数学模型，来研究游离和簇状的雷诺丁受体对调节Ca²⁺波的相互作用。Ca²⁺波的计算结果与心肌细胞的实验测量一致。结果显示，在心肌细胞的角落有四个相邻的Ca²⁺火花可以诱导Ca²⁺波。Ca²⁺夸克能够增加激发Ca²⁺火花的概率，并加速Ca²⁺波在高[Ca²⁺]lumen腔内的传播。所以，提出了一种新的“火花-扩散-夸克-火花”的波传播模式。特别地，计算结果表明，只有当[Ca²⁺]lumen的浓度高于临界值0.7mM时，Ca²⁺波才会出现。肌浆网终池中的游离雷诺丁受体导致了更多的游离和簇状雷诺丁受体的激发。另外，从游离雷诺丁受体的钙释放单元(CRUs)中释放Ca²⁺，是一个较强的波属性因子。同时本发明还有助于了解心肌细胞中Ca²⁺波的基本机制。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。