一种检测水体细菌数量的荧光显微计数方法与流程

本发明属于水体细菌计数技术领域，尤其涉及一种检测水体细菌数量的荧光显微计数方法。

背景技术：

水生细菌是生长在水体中的一类超微型水生物。是水生物群落中的一个重要成员。型体从零点几到几十微米。种类多，有球菌、杆菌、弧菌、螺旋菌等。按栖息环境分为底栖性细菌和浮游性细菌两大类。结构简单，具细胞壁、细胞质膜、细胞质、细胞核等，在生物进化中处于低级水平。繁殖快，20—30min分裂一次。分布广。数量多少与水体肥力及水质优劣有密切关系。水生细菌是完成水域食物链主要环节，在代谢过程中，把有机物(包括生物尸体)分解为无机盐(磷酸盐、硝酸盐)、二氧化碳和水等，供绿色植物所利用。在水体自净和废水生化处理中细菌数量最多，是活性污泥主要构成者，呈絮状菌胶团，能很快吸附废水中有机物，在厌氧菌、好氧菌作用下，污染物质被降解和转化，使污水得到净化。细菌的过量繁殖，可引起水体污染，威胁人体健康，因此，细菌总数、大肠菌群及致病菌等是评价水体质量的重要卫生学指标。然而，现有检测水体细菌数量的荧光显微计数过程中对焦速度慢、稳定性差；同时，采集的图像分辨率低，清晰度差。

综上所述，现有技术存在的问题是：现有检测水体细菌数量的荧光显微计数过程中对焦速度慢、稳定性差；同时，采集的图像分辨率低，清晰度差。传统sofi算法需要成千上百张图像，降低了图像处理的速度，原始图像的信噪比决定了算法处理所需的原始图像数量；传统显微镜的物镜象场面积较小，且象场弯曲严重；同时物镜采用有限象距，导致色差大，需要进行多次校正。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种检测水体细菌数量的荧光显微计数方法。

本发明是这样实现的，一种检测水体细菌数量的荧光显微计数系统包括：

光源模块、图像采集模块、中央控制模块、对焦模块、滤色模块、放大模块、图像处理模块、标记模块、显示模块；

光源模块，与中央控制模块连接，用于通过超高压汞灯对水体进行照明；

图像采集模块，与中央控制模块连接，用于通过荧光显微镜采集水体细菌图像数据；

中央控制模块，与光源模块、图像采集模块、对焦模块、滤色模块、放大模块、图像处理模块、标记模块、显示模块连接，用于通过单片机控制各个模块正常工作；

对焦模块，与中央控制模块连接，用于通过物镜调节对水体样本的焦距进行对焦操作；

滤色模块，与中央控制模块连接，用于通过激发滤板、压制滤板对显示的荧光细菌进行滤色操作；

放大模块，与中央控制模块连接，用于通过物镜和目镜放大水体细菌荧光图像；

图像处理模块，与中央控制模块连接，用于通过图像处理软件对采集的图像进行提高分辨率操作；

标记模块，与中央控制模块连接，用于通过标记程序对细菌荧光图像的荧光进行标记计数；

显示模块，与中央控制模块连接，用于通过显示器显示采集的具有荧光的水体细菌图像及标记数据。

一种检测水体细菌数量的荧光显微计数方法包括以下步骤：

步骤一，通过光源模块超高压汞灯对水体进行照明；通过图像采集模块利用荧光显微镜采集水体细菌图像数据；

步骤二，中央控制模块通过对焦模块利用物镜调节对水体样本的焦距进行对焦操作；

步骤三，通过滤色模块利用激发滤板、压制滤板对显示的荧光细菌进行滤色操作；

步骤四，通过放大模块利用物镜和目镜放大水体细菌荧光图像，通过图像处理模块利用图像处理软件对采集的图像进行提高分辨率操作；

步骤五，通过标记模块利用标记程序对细菌荧光图像的荧光进行标记计数；

步骤六，通过显示模块利用显示器显示采集的具有荧光的水体细菌图像及标记数据。

进一步，所述对焦模块方法如下：

(1)在轴向扫描荧光样本过程中选取多个清晰对焦的特征区域，并记录每个特征区域的清晰图像和位置；

(2)利用记录的所述清晰图像对移动后采集的样本图像进行匹配，并更新各个子区域的中心坐标。

(3)根据每个对焦区域的中心坐标获取角度和轴向位置的移动量，以移动后进行图像匹配对准，并测量所述每对焦区域的中心坐标后再次迭代优化，以实现对焦。

进一步，所述步骤(1)包括：

移动所述荧光样本至视场中心范围；

轴向移动所述荧光样本到显微镜视场中有一个位置附近的图像最清晰，并记第n次选取的区域为in，记录该区域的轴向位置zn⁰和中心坐标(xn⁰,yn⁰)；

检测清晰视场的个数；

如果所述个数大于预设值，则停止选取。

进一步，所述步骤(3)包括：

根据各子图中心的水平坐标(xnⁱ,ynⁱ)和轴向位置znⁱ得到俯仰台旋转角θ，φ和轴向位移台移动距离z；

根据所述俯仰台旋转角θ，φ和轴向位移台移动距离z依次驱动俯仰台和轴向平移台移动。

进一步，所述步骤(2)包括：

轴向移动所述荧光样本，对子图in采用图像匹配算法以寻找到最新的水平坐标(xnⁱ,ynⁱ)和轴向位置znⁱ；

判断不同子区域的轴向位置znⁱ是否满足预设条件；

如果满足，则将轴向位移台移动到平均位置，对焦完成。

进一步，所述图像处理模块方法如下：

1)通过高斯函数或贝塞尔函数拟合显微镜的点扩散函数，通过显微镜的低分辨记录相机记录真实图像x的低分辨图像y，x∈r^n×n，y∈r^m×m，n≥4m，m和n都是自然数；

2)以真实图像x每个像素中心为点扩散函数的源点，计算点扩散函数在低分辨记录相机记录的低分辨图像y上的各个像素点上的数值，然后按行或列首尾相接，形成一基于点扩散函数的列向量φj，基于真实图像x每个像素中心的点扩散函数的列向量按照所有真实图像x每个像素中点行或列首尾相接的次序排列构成基于点扩散函数的矩阵φ，其中φj是φ的第j列；

3)基于双三次插值法，对低分辨率图像y做插值处理，得到插值后的近似高分辨率图像yha，并将yha一维化成yha，yha∈r^2m×2m，

4)以真实图像x每个像素中心为点扩散函数的源点，计算点扩散函数在高分辨记录相机记录的高分辨图像yh上的各个像素点上的数值，然后按行或列首尾相接，形成一基于点扩散函数的列向量φjh，基于真实图像x每个像素中心的点扩散函数的列向量按照真实图像x每个像素中点行或列首尾相接的次序排列构成基于点扩散函数的矩阵φh，其中φjh是φh的第j列，yh∈r^2m×2m；

5)通过传统的信号重构算法重构超分辨率图像x，其中传统的信号重构算法指的是压缩感知领域的重构算法：

min||x||0s.t.yha＝φhx；

6)把一维图像x二维化成xa,xa是真实图像x的近似解。

本发明的优点及积极效果为：本发明通过对焦模块采用图像匹配相关函数进行调焦，克服了传统清晰度函数无法直接用于荧光图像的问题，采用轴向-角度交替优化算法进行调焦，加快收敛速度，采用迭代算法调焦，适用于样本在调节过程中发生变化的情况，适用于宽视场荧光成像，有效提高了对焦速度和稳定性；同时，通过图像处理模块利用荧光显微镜的低分辨记录相机记录真实图像x的低分辨图像y,并对之做插值处理，然后通过φh重构真实图像；大大提高图像分辨率，使图像更加清晰，便于对细菌计算数量。本发明提供的改进的sofi方法在不改变光片荧光显微镜的任何结构情况下，可获得两倍横向分辨率的提高，突破成像物镜对于分辨率的限制。平场消色差物镜的象场面积增大了一倍，并使象场弯曲得到了很好的校正；利用无限远光学系统改进物镜，成象光束没有不会受到光学附件的干扰，物象的质量不会受到损害，简化了物镜设计中色差和象差的校正。

附图说明

图1是本发明实施例提供的检测水体细菌数量的荧光显微计数方法流程图。

图2是本发明实施例提供的检测水体细菌数量的荧光显微计数系统结构框图。

图2中：1、光源模块；2、图像采集模块；3、中央控制模块；4、对焦模块；5、滤色模块；6、放大模块；7、图像处理模块；8、标记模块；9、显示模块。

具体实施方式

为能进一步了解本发明的发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例，并配合附图详细说明如下。

下面结合附图对本发明的结构作详细的描述。

如图1所示，本发明提供的检测水体细菌数量的荧光显微计数方法包括以下步骤：

步骤s101，通过超高压汞灯对水体进行照明；利用基于改进的sofi方法优化的荧光显微镜采集水体细菌图像数据；

步骤s102，利用物镜调节对水体样本的焦距进行对焦操作；

步骤s103，利用激发滤板、压制滤板对显示的荧光细菌进行滤色操作；

步骤s104，利用改进的物镜和目镜放大水体细菌荧光图像，利用图像处理软件对采集的图像进行提高分辨率操作；

步骤s105，利用标记程序对细菌荧光图像的荧光进行标记计数；

步骤s106，利用显示器显示采集的具有荧光的水体细菌图像及标记数据。

步骤s101中，本发明实施例提供的基于改进的sofi方法包括：

在荧光显微镜上加入两个小波滤波器，在时间上，采用基于一维小波变换的高通滤波器在消除低频背景波动信号，空间上，利用基于二维小波变换的低通滤波器来消除高频读出噪声；从而降低原始图像的信噪比，进而减少采集的图像的数量，提高成像速度；

小波滤波器去噪原理：对于一个二维图像，小波变换相当于在水平方向和垂直方向上交替进行滤波和采样；小波变换每次分解产生一个低频子图和三个高频子图(水平子图、垂直子图和对角子图)；低频子图反映原始图像的主体轮廓信息，水平子图、垂直子图和对角子图分别反映图像的水平、垂直和对角方向的边缘细节信息；以平滑函数的一阶导数为母小波进行小波变换，其小波变换在各尺度下系数的模极大值对应信号突变点，即图像的边缘位置，边缘点进行边缘匹配和连接，构成原始图像的边缘定位；小波变换把图像信号变换到小波域，在小波域中，图像的主要能量集中在低分辨率的尺度系数和一些较大的小波系数上，而噪声仍然分布在低分辨率的尺度系数和所有小波系数上；在变换域，图像的相关性降低，能量更加集中而噪声的能量分布情况不变；

改进的sofi方法具体步骤：首先对原始图像进行小波分解，然后找到一个合适的阈值，对小波分解系数进行阈值处理，达到抑制噪声的目的，再对处理后的系数重构，即得到去除噪声之后的图像。

步骤s104中，本发明实施例提供的物镜改进方法包括：

采用平常消色差物镜，并将物镜象距设计为无限远；

平场消色差物镜的高度校正的初次放大平面象的直径为28mm，即象场面积增大了一倍，并使象场弯曲得到了很好的校正；物镜象距为无限远，当入射光从试样表面反射再次进入物镜后，并不收敛而是保持为平行光束，直到通过镜筒透镜后才收敛并形成中间象，即一次放大实象,然后才供目镜再次放大。

现今新型显微镜已经普遍使用平场消色差物镜，甚至还可以配置更高级的平场复消色差物镜.老式物镜初次放大实象的直径只有18mm～20mm。

如图2所示，本发明提供的检测水体细菌数量的荧光显微计数系统包括：光源模块1、图像采集模块2、中央控制模块3、对焦模块4、滤色模块5、放大模块6、图像处理模块7、标记模块8、显示模块9。

光源模块1，与中央控制模块3连接，用于通过超高压汞灯对水体进行照明；

图像采集模块2，与中央控制模块3连接，用于通过荧光显微镜采集水体细菌图像数据；

中央控制模块3，与光源模块1、图像采集模块2、对焦模块4、滤色模块5、放大模块6、图像处理模块7、标记模块8、显示模块9连接，用于通过单片机控制各个模块正常工作；

对焦模块4，与中央控制模块3连接，用于通过物镜调节对水体样本的焦距进行对焦操作；

滤色模块5，与中央控制模块3连接，用于通过激发滤板、压制滤板对显示的荧光细菌进行滤色操作；

放大模块6，与中央控制模块3连接，用于通过物镜和目镜放大水体细菌荧光图像；

图像处理模块7，与中央控制模块3连接，用于通过图像处理软件对采集的图像进行提高分辨率操作；

标记模块8，与中央控制模块3连接，用于通过标记程序对细菌荧光图像的荧光进行标记计数；

显示模块9，与中央控制模块3连接，用于通过显示器显示采集的具有荧光的水体细菌图像及标记数据。

本发明提供的对焦模块4方法如下：

(1)移动所述荧光样本至视场中心范围；在轴向扫描荧光样本过程中选取多个清晰对焦的特征区域，并记录每个特征区域的清晰图像和位置；轴向移动所述荧光样本到显微镜视场中有一个位置附近的图像最清晰，并记第n次选取的区域为in，记录该区域的轴向位置zn⁰和中心坐标(xn⁰,yn⁰)；检测清晰视场的个数；如果所述个数大于预设值，则停止选取；

(2)利用记录的所述清晰图像对移动后采集的样本图像进行匹配，并更新各个子区域的中心坐标；

(3)轴向移动所述荧光样本，对子图in采用图像匹配算法以寻找到最新的水平坐标(xnⁱ,ynⁱ)和轴向位置znⁱ；判断不同子区域的轴向位置znⁱ是否满足预设条件；如果满足，则将轴向位移台移动到平均位置，对焦完成；若不满足，则根据每个对焦区域的中心坐标获取角度和轴向位置的移动量，根据各子图中心的水平坐标(xnⁱ,ynⁱ)和轴向位置znⁱ得到俯仰台旋转角θ，φ和轴向位移台移动距离z；根据所述俯仰台旋转角θ，φ和轴向位移台移动距离z依次驱动俯仰台和轴向平移台移动；移动后进行图像匹配对准，并测量所述每对焦区域的中心坐标后再次迭代优化，以实现对焦。

本发明实施例提供的图像处理模块7方法如下：

1)通过高斯函数或贝塞尔函数拟合显微镜的点扩散函数，通过显微镜的低分辨记录相机记录真实图像x的低分辨图像y，x∈r^n×n，y∈r^m×m，n≥4m，m和n都是自然数；

2)以真实图像x每个像素中心为点扩散函数的源点，计算点扩散函数在低分辨记录相机记录的低分辨图像y上的各个像素点上的数值，然后按行或列首尾相接，形成一基于点扩散函数的列向量φj，基于真实图像x每个像素中心的点扩散函数的列向量按照所有真实图像x每个像素中点行或列首尾相接的次序排列构成基于点扩散函数的矩阵φ，其中φj是φ的第j列；

3)基于双三次插值法，对低分辨率图像y做插值处理，得到插值后的近似高分辨率图像yha，并将yha一维化成yha，yha∈r^2m×2m，

4)以真实图像x每个像素中心为点扩散函数的源点，计算点扩散函数在高分辨记录相机记录的高分辨图像yh上的各个像素点上的数值，然后按行或列首尾相接，形成一基于点扩散函数的列向量φjh，基于真实图像x每个像素中心的点扩散函数的列向量按照真实图像x每个像素中点行或列首尾相接的次序排列构成基于点扩散函数的矩阵φh，其中φjh是φh的第j列，yh∈r^2m×2m；

5)通过传统的信号重构算法重构超分辨率图像x，其中传统的信号重构算法指的是压缩感知领域的重构算法：

min||x||0s.t.yha＝φhx；

6)把一维图像x二维化成xa,xa是真实图像x的近似解。

以上所述仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。