1.本发明涉及一种统计多色荧光图片中细胞数量和面积的方法。
背景技术：
2.为了统计多色荧光图片中细胞数量和面积，现有的方法是通过imagej等图像处理软件，将多色荧光图片的三原色图片逐张导入软件后，通过设置颜色阈值来统计多色荧光图片中细胞的数量和面积。现有的方法无法直接计算细胞绝对大小，无法批量高效分析大量荧光图片数据。
技术实现要素：
3.本发明要解决的技术问题是：现有的统计多色荧光图片中细胞数量和面积的方法无法直接计算细胞绝对大小，无法批量高效准确地分析大量荧光图片数据。
4.为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是提供了一种基于多色荧光图片的细胞数量和面积的统计方法，其特征在于，包括以下步骤：
5.步骤1、获得多色荧光图片，将多色荧光图片按照三原色分离为三张不同的图片；
6.步骤2、对分离得到三张图片分别进行处理，获得单张图片的细胞数量和细胞面积，其中，采用以下步骤获得单张图片的细胞数量和细胞面积：
7.步骤201、调节用于过滤背景的颜色值的下限，以去除图片的背景和噪音，获得与图片大小相同的细胞蒙板；
8.步骤202、去除图片中未被细胞蒙板遮盖的部分，获得细胞蒙板图片；
9.步骤203、将细胞蒙板图片转换为灰度图片后，通过高斯滤波模糊灰度图片边缘；
10.步骤204、对经过步骤203处理得到的灰度图片进行侵蚀扩张处理后，通过边缘跟踪算法，检测细胞外轮廓，获得灰度图片中存在的n个细胞外轮廓，n≥1；
11.步骤205、对于每个细胞外轮廓，获得组成当前细胞外轮廓的所有像素点，分别判断每个像素点的梯度是否是周围具有相同梯度方向的像素点中最大的，若是，则保留当前像素点，否则剔除当前像素点；
12.步骤206、经过步骤205处理后，若组成当前细胞外轮廓的像素点的个数小于设定的阈值，则将当前细胞外轮廓剔除，从而从n个细胞外轮廓中过滤得到m个细胞外轮廓，1≤m≤n
13.步骤206、基于步骤204筛选得到的m个细胞外轮廓进一步利用凸包函数获得准确的围绕整个细胞形成轮廓的各像素点，获得准确的m个细胞的外轮廓；
14.步骤207、统计步骤206获得的外轮廓的数量，从而得到细胞数量；统计被每个外轮廓所围的像素点的总个数，利用被当前外轮廓所围的像素点的总个数结合预设的图片大小计算得到当前外轮廓所对应细胞的细胞面积，由此获得所有的细胞面积；
15.步骤3、统计由当前多色荧光图片分离得到的三张图片的细胞数量和细胞面积，对所有细胞面积按照大小进行隔断统计，从而将三张图片的细胞数量和细胞面积合并后获得
当前多色荧光图片的细胞数量和细胞面积。
16.优选地，步骤201中，通过滑动框调节过滤背景的颜色值的下限。
17.优选地，步骤202中，通过图片的非门算法，将细胞蒙板与图片做非运算去除图片中未被细胞蒙板遮盖的部分。
18.本发明提供的一种荧光细胞计数方法能够批量且准确地对荧光图片中的细胞数量和大小进行分析，从而解决了现有免疫荧光、tunel、edu等多色荧光染色细胞计数方法存在计数、面积统计效率和准确率较低，操作繁琐等问题。
具体实施方式
19.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
20.本发明提供了一种基于多色荧光图片的细胞数量和面积的统计方法，包括以下步骤：
21.步骤1、获得多色荧光图片，将多色荧光图片按照三原色(蓝色、绿色、红色)分离为三张不同的图片；
22.步骤2、对分离得到三张图片分别进行处理，获得单张图片的细胞数量和细胞面积，其中，采用以下步骤获得单张图片的细胞数量和细胞面积：
23.步骤201、通过滑动框调节用于过滤背景的颜色值的下限，以去除图片的背景和噪音，获得与图片大小相同的细胞蒙板；
24.步骤202、通过图片的非门算法，将细胞蒙板与图片做非运算去除图片中未被细胞蒙板遮盖的部分，获得细胞蒙板图片；
25.步骤203、将细胞蒙板图片转换为灰度图片后，通过高斯滤波模糊灰度图片边缘；
26.步骤204、对经过步骤203处理得到的灰度图片进行侵蚀扩张处理后，通过边缘跟踪算法，检测细胞外轮廓，获得灰度图片中存在的n个细胞外轮廓，n≥1；
27.步骤205、对于每个细胞外轮廓，获得组成当前细胞外轮廓的所有像素点，分别判断每个像素点的梯度是否是周围具有相同梯度方向的像素点中最大的，若是，则保留当前像素点，否则剔除当前像素点；
28.步骤206、经过步骤205处理后，若组成当前细胞外轮廓的像素点的个数小于50个，则将当前细胞外轮廓剔除，从而从n个细胞外轮廓中过滤得到m个细胞外轮廓，1≤m≤n
29.步骤206、基于步骤204筛选得到的m个细胞外轮廓进一步利用凸包函数获得准确的围绕整个细胞形成轮廓的各像素点，获得准确的m个细胞的外轮廓；
30.步骤207、统计步骤206获得的外轮廓的数量，从而得到细胞数量；统计被每个外轮廓所围的像素点的总个数，利用被当前外轮廓所围的像素点的总个数结合预设的图片大小计算得到当前外轮廓所对应细胞的细胞面积，由此获得所有的细胞面积；
31.步骤3、统计由当前多色荧光图片分离得到的三张图片的细胞数量和细胞面积，可根据实验设计，计算阳性细胞比例以及细胞大小分布。
32.本发明通过将荧光图像的特定颜色提取后，转换为灰度图像，手动调节阈值排除
噪点(提高数据精确度)，自动识别矫正后图像中的细胞，再基于细胞形状产生蒙板，通过对蒙板大小和数量的统计得出荧光细胞的数量和面积，减少了计数步骤，提高仅依赖灰度值进行的细胞识别，从而提高了细胞计数、面积统计的效率和准确率，且操作简便。