一种细胞微流变特征快速提取方法

1.本发明属于流变特性测量技术领域，涉及一种细胞微流变特征快速提取方 法，是一种基于粒子追踪技术、微流变学、神经网络算法等相关原理的方法。


背景技术：

2.细胞的流变性质与细胞分裂、增值、迁移及胞内生命活动均密切相关，可 用以指示细胞状态的改变和各类疾病的发生。细胞微流变学将细胞流变特性测 量方法从宏观、平均、粗粒化水平跨越到了微观、局部、精细化水平，将进一 步拓展人们对细胞微观特性的认识和理解，为细胞机制探索、疾病早期诊断、 药物运输等重要应用提供技术手段，具有重要价值。
3.细胞流变特性的测量一直是国内外研究热点。早期的研究往往以细胞群落 作为研究对象，关注整个细胞群落的力学特性，所测得的是某些细胞力学特征 参量的均值。随着研究的深入和技术的发展，单细胞流变特性的测量越来越引 起关注。传统的单细胞流变特性测量主要依赖于原子力显微镜、光镊、微管吮 吸及微流控芯片等技术手段。然而，这些方法所测量的多为细胞的表观流变特 性，较难测量细胞胞内的微流变特性。粒子追踪技术是一种随着时间推移最终 粒子运动的直观测量方法，可提供运动粒子的详细位移信息，被广泛应用于高 分子物理、生物物理、反常扩散等研究。有研究提出基于粒子追踪的微流变测 量技术，用于测量复杂流体的流变特性。一些研究则将该方法应用到细胞微观 流变的测量，但需要进行大量的数据处理和复杂的反演算法，且不同实验测得 的流变特征参数差别较大。
4.近年来机器学习领域飞速发展，目前已成为整个计算机领域中最活跃、应 用潜力最显著的领域之一，在股票价格预测，x射线脉冲特性预测等方面有着 极大的应用。径向基函数网络是一种结构简单、收敛速度快、能够逼近任意非 线性函数的网络，而广义回归神经网络作为径向基函数网络的一种变形形式， 具有良好的非线性逼近功能，在信号过程、结构分析、控制决策系统等各个学 科和工程领域得到了广泛应用。受此启发，为克服现有基于粒子追踪微流变技 术的缺陷，申请人提出了一种结合粒子追踪微流变技术和广义神经网络算法的 细胞微流变特征快速提取方法。
5.本发明基于粒子追踪微流变学技术，提出一种广义回归神经网络辅助的细 胞微流变特征快速提取方法。


技术实现要素：

6.本发明是一种基于粒子追踪技术的广义回归神经网络辅助的细胞微流变特 征快速提取方法。实验采用荧光显微成像的单粒子追踪法测量荧光聚苯乙烯纳 米粒子的扩散运动，经过处理后得到细胞运动轨迹图像；由轨迹图像得到探针 颗粒运动轨迹和单步位移之后，通过公式计算出细胞均方位移(msd)数据； 由得出的msd数据根据微流变特征公式使用算法反演出细胞的黏度、蠕变柔量、 复合模量和粘弹性模量等微流变特性。进一步，可建
立广义回归神经网络进行 快速准确反演，直接由细胞的msd数据得到细胞的各种微流变特性。
7.本发明的技术方案如下：
8.一种基于粒子追踪技术的广义回归神经网络辅助的细胞微流变特性快速提 取方法，具体步骤如下：
9.将内皮细胞(endothelial cells，ecs)悬浮液以一定密度转入玻璃皿中进行 培养，待细胞完全贴壁后，加入含有荧光纳米颗粒(优选聚苯乙烯荧光纳米颗 粒)的细胞培养基，将细胞放入培养箱中继续进行培养。此时细胞通过对外界 物质的胞吞作用向胞内引入纳米颗粒，数小时后观察颗粒是否进入细胞内部， 若在胞内发现荧光纳米颗粒，则可以准备记录纳米颗粒在细胞内的轨迹。从细 胞培养箱中取出玻璃皿，弃掉其中培养基，将其置于显微镜装置下观测和记录 细胞内部纳米颗粒的运动轨迹。首先在明场下使用100倍油浸物镜寻找到单个 细胞，调焦至清晰看到细胞，拍摄一张图片作为对比；紧接着，在焦平面不变 的情况下，关掉明场，转至纳米颗粒相应激发荧光下记录颗粒的运动轨迹，每 组实验至少重复3次以上，每次记录10-15个细胞。如
10.图2所示，(a)是20倍镜下内皮细胞的成像示意图，(b)和(c)是100倍油 浸物镜下单个细胞的成像图，其中(c)是100nm颗粒在细胞内的荧光图像。
11.在获得颗粒运动的视频图像后，为了得到纳米颗粒的运动轨迹，要对图像 进行处理。首先，采用“高斯模糊”和“锐化”处理图像(可以选择采用imagej(nih) 软件)，通过过滤图像对背景噪声进行处理，提高信噪比，便于后期颗粒的识 别和追踪。
12.接下来，对颗粒的轨迹进行追踪，可以选择使用自编程的matlab 2019a算 法来实现。其原理是：以水的黏度η作为溶液的黏度、粒径的大小d、曝光时间δt， 通过公式d0＝(kb×
t)/(6πηd)和计算出理论的扩散系数d0和均方 位移l，其中，kb表示玻尔兹曼常数，t表示温度，并以l的长度作为搜索区域； 如果在下一帧这个区域内出现一个颗粒，被认为是同一颗粒；若出现多个颗粒， 为了防止颗粒之间的干扰，结束本次搜索。
13.得到颗粒运动轨迹和单步位移之后，均方位移(msd)采用下式进行计算：
[0014][0015]
其中，ri表示颗粒在i时刻的位置，n为拍摄得到的颗粒运动总步数，k表示 时间间隔δt的整数倍。
[0016]
因此上式表示颗粒在k个时间间隔内的均方位移，即msd-t的关系。多次实 验，得到多组msd-t数据，对msd求平均，得到emsd-t数据。
[0017]
由所得的emsd数据根据细胞微流变特性公式通过matlab算法求出微流 变特性，其中黏度公式为：
[0018][0019]
其中kb为玻尔兹曼常量，t为温度，t为时间，a为细胞半径。(本方法只 考虑温度为37℃的情况，因此kbt≈4.2pn*nm)。
[0020]
蠕变柔量公式为：
[0021][0022]
复合模量公式为：
[0023][0024]
其中a为细胞半径，ω为频率，i表示复数虚部，fu[δr2(t)]为《δr2(t)》的单侧 傅里叶变换。可利用matlab中的快速傅里叶(fft)算法求出《δr2(t)》的傅里 叶变换。
[0025]
以已得的复合模量数据为基础，利用公式与算法计算弹性模量与粘性模量。 根据已求复合模量，将复合模量的实部和虚部分别对应于弹性模量和粘性模量， 公式如下：
[0026]g*
(ω)＝g'(ω)+ig”(ω)
ꢀꢀ
(5)
[0027]
基于以上公式利用算法求出细胞微流变特性，基于已求得的细胞微流变特 性和相应的msd建立广义回归神经网络(grnn)，如图3所示，构建的广义 回归神经网络具有输入层、隐含层、加和层和输出层。
[0028]
首先，将已获得的ecs的e-msd数据(100组)进行分组，分为训练组和 测试组：用等间距抽样的方法选取测试组，剩余的数据归为训练组(最终共有 80组训练组和20组测试组)。
[0029]
令x＝[t,emsd]，即时间t和对应的均方位移《
△
r2(t)》组合作为二维输入，细 胞的微流变特性作为输出y。已知x的某一观测值x0，y相对于x的回归为：
[0030][0031]
y(x0)即在输入为x0的条件下，y的预测输出。应用parzen非参数估计，可 由样本数据集按下式估算密度函数f(x0,y)：
[0032][0033][0034]
d(y,yi)＝[y-yi]2ꢀꢀ
(9)
[0035]
其中n为样本数量(n＝80)，p为变量x的维数(p＝2)，σ为光滑因子(本 方法取σ＝0.5)。将式(8)-(9)代入式(7)并交换积分和求和顺序得到：
[0036]
[0037]
由于化简上式，可得
[0038][0039]
由上式易得grnn隐含层节点数等于，输入的样本数量(80)，其中第k 个节点的输出为yk为该节点所对应的期望输出。加和层第一个节点的 输出为：
[0040][0041]
第二个节点的输出为：
[0042][0043]
最终输出层的输出为第一个节点的输出除以第二个节点的输出，从而得到细胞 微流变特征。
[0044]
本发明的有益效果：本发明将粒子追踪技术和流体力学相结合，建立了细 胞内部均方位移和微流变特性的关系。通过荧光显微成像的单粒子追踪法测量 荧光聚苯乙烯纳米粒子的扩散运动，经过处理后得到细胞运动轨迹图像并经过 计算处理得到粒子的均方位移后，即可通过本发明的方法快速准确地计算细胞 的微流变特性。
附图说明
[0045]
图1是本发明的装置结构示意图。图中：1为计算机；2为倒置荧光显微镜； 3为粒子轨迹图像。
[0046]
图2是细胞成像：(a)为内皮细胞在20倍镜下的细胞图像；(b)为单个 内皮细胞在100倍镜下的细胞成像图；(c)细胞内100nm颗粒的荧光图像； (d)为单个100nm颗粒扩散轨迹。
[0047]
图3是全连接人工神经网络模型框架示意图。其中两个输入为时间和均方 位移，输出为细胞的微流变特性，广义回归神经网络包括输入层、隐含层、加 和层和输出层，图中神经元数目和层数仅为示意。
[0048]
图4是利用算法求解内皮细胞微流变特性的结果。其中(a)为细胞粘性， (b)为蠕变柔量，(c)为复合模量，(d)为的粘弹性模量。
[0049]
图5是利用grnn反演所求得的内皮细胞微流变特性的结果。其中(a)为 黏度预测结果，(b)为蠕变柔量预测结果。(c)为复合模量的预测结果，(d) 为粘弹性模量的预测结果。
具体实施方式
[0050]
下面的实施例将对本发明予以进一步说明，但并不因此限制本发明的保护 范围。
[0051]
现针对一种细胞微流变特征快速提取方法，阐述具体实施方式：
[0052]
如图1本实例用到的装置包括：用于记录纳米颗粒运动轨迹和提取细胞微 流变特征的计算机1、用于观察和成像细胞的倒置荧光显微镜2。利用该装置进 行细胞微流变特征快速提取包括以下环节：
[0053]
(一)胞内纳米颗粒轨迹提取
[0054]
步骤一：将图2中的(a)所示的一个长满ecs细胞的培养皿进行消化，制备 ecs细胞悬浮液。之后以一定密度转入玻璃皿中进行培养，待细胞完全贴壁后， 加入含有100nm聚苯乙烯荧光纳米颗粒的细胞培养基，将细胞放入培养箱中继 续进行培养。12个小时后，从细胞培养箱中取出玻璃皿，弃掉其中培养基，将 其置于显微镜装置下观测和记录细胞内部纳米颗粒的运动轨迹。首先如图2中 的(b)所示，在明场下使用100倍油浸物镜寻找到一个细胞，调焦至清晰看到细 胞，拍摄一张明场细胞图作为定位和对比；紧接着，在焦平面不变的情况下， 关掉明场，转至绿色激发荧光下观察并记录正在运动中纳米颗粒的轨迹。纳米 颗粒在细胞内静止图如2中的(c)所示，每组实验至少重复3次以上，每次记录 10-15个细胞。
[0055]
步骤二：在获得颗粒运动的视频图像后，为了得到纳米颗粒的运动轨迹， 要对图像进行处理。将图像导入imagej(nih)软件中，先进行“高斯模糊”，然 后“锐化”两次来处理图像。经过处理后的图像对比度有了明显的提升，颗粒的识 别度也大大增加。但如果某个纳米颗粒由于不在同一焦平面运动，在观察时出 现时隐时现的现象，则将灰度阈值设定为随时间变化的动态值。颗粒的荧光强 度比背景灰度值要高，使用高斯拟合灰度值识别每个颗粒的质心位置；再通过 拟合动态灰度阈值来识别颗粒，当某点灰度值大于拟合的动态灰度阈值时，将 其视为颗粒，否则作为背景信号处理。这步需要注意的是，在计算灰度值的轮 廓图来识别颗粒时，拟合的动态灰度阈值要确保在每帧图像中识别尽可能多的 纳米颗粒。
[0056]
步骤三：使用自编程的matlab 2019a算法来计算出每个颗粒的运动轨迹。 原理是：以水的黏度η作为溶液的黏度、粒径的大小d、曝光时间δt，通过公 式和计算出理论的扩散系数和均方位移l，公式如下：
[0057][0058][0059]
并以l的长度作为搜索区域；如果在下一帧这个区域内出现一个颗粒，被认为 是同一颗粒；若出现多个颗粒，为了防止颗粒之间的干扰，结束本次搜索。例 如图2中的(d)，在得到颗粒运动轨迹和单步位移之后，采用(公式1)计算其均 方位移(msd)。
[0060]
(二)算法计算
[0061]
得到纳米颗粒的均方位移数据后，根据细胞微流变公式，使用算法计算出 细胞的微流变特性。对于细胞粘度和蠕变柔量，可直接将时间t和均方位移
[0062]
《δr2(t)》代入粘度公式(公式(2))和蠕变柔量公式(公式(3))中求出两种 细胞的黏度值和蠕变柔量值。
[0063]
计算细胞模量值时，首先应将离散的均方位移进行傅里叶变换，本方法中 的msd是由100个离散值组合成的序列，则傅里叶变换公式如下：
[0064][0065]
其中n＝100。经傅里叶变化后，利用(公式4)求出细胞的复合模量，细胞的复 合模量值是一个复数，分别将复合模量的实部和虚部分别对应于弹性模量和粘 性模量，求出细胞的粘弹性模量。至此细胞的微流变特性全部求解完毕。
[0066]
(三)grnn快速反演
[0067]
本例将上一步骤算法计算得出的细胞微流变特性值作为真值，以时间和对 应的均方位移作为输入，以细胞微流变特性作为输出构建广义回归神经网络如 图3所示。构建的神经网络包括输入层、隐含层、加和层和输出层共四层。
[0068]
首先，将数据进行分类。共100组数据，用等间距抽样的方法选取测试组， 剩余的数据归为训练组,最终共有80组训练组和20组测试组，且相邻测试组时 间间隔为0.05s。在grnn中隐含层的结点数等于训练组的个数，因此本例中 grnn隐含层结点数为80。grnn神经网络不需要训练，但光滑因子σ作为神 经网络的重要参数，对网络性能的影响很大需要优化取值，本例取σ＝0.5。确定 光滑因子后，将训练组代入构建grnn。
[0069]
得到grnn后，将20组测试组输入进网络中进行预测，得到的细胞微流变 特性再与真值进行比较，最终结果如表1所示。其各个微流变特征的平均相对 误差为0.76％，且用时均在0.1s内。得到的相对误差仅供参考，实际实施的误 差与采样精度，训练所使用数据集等因素相关。
[0070]
表1 grnn反演所得内皮细胞微流变特性的相对误差和用时。
[0071]