一种基于响应面法优化提取钩吻生物碱的方法

本发明属于植物提取，涉及一种基于响应面法优化提取钩吻生物碱的方法。

背景技术：

1、钩吻，马钱科葫蔓藤属植物，其茎皮根均可入药，有祛风除湿，强筋壮骨之效。钩吻有多种生物碱成分，对免疫系统、中枢神经系统均有作用；此外还有抗炎、抗肿瘤作用、促生长作用。已有研究表明，钩吻素子能显著增加大鼠进入高架十字迷宫开臂次数以及在开臂的停留时间百分率，说明钩吻素子可能具有镇静和缓解焦虑作用。halstead等研究表明，以低浓度的钩吻生物碱作用于人sh-sy5y神经细胞，通过转录组分析可以发现炎症信号通路的相关调控基因发生了显著变化，说明钩吻生物碱具有抗炎作用。刘道荣在1994年就已发现并报道，在生猪饲喂过程中添加钩吻，其促增重效果明显，说明钩吻具有促生长作用。另外，还有研究钩吻生物碱抗焦虑、抗肿瘤等药理作用。

2、关于钩吻生物碱的提取较多，但提取的钩吻生物碱含量低，不利于钩吻的利用率，关于提取钩吻生物碱有效组分的报道较少，采用响应面法优化钩吻提取研究也尚未有报道。

技术实现思路

1、针对现有钩吻生物碱提取方法中，钩吻生物碱的提取含量少，钩吻的利用率不高的技术缺陷，本发明的目的是在于提供一种基于响应面法优化提取钩吻生物碱的制备方法，利用响应面法对钩吻生物碱的提取工艺进行优化，以总生物碱吸光度(od值)为指标，对乙醇浓度、提取时间和浸润时间3因素进行考察，利用box-behnken对试验进行三因素三水平的响应面法优化，得出了一种提取优化钩吻生物碱的方法，有效避免了正交试验精度不够的缺点，且可保证提取的科学性和稳定性。本发明利用响应面法优化钩吻提取纯化，将复杂的多元关系可视化为简单的二维或三维图，并使用较少的试验次获得对因变量影响因素的有效信息具有高效和低成本的优势。该方法所提出的工艺科学、合理，具有安全可靠和收率高的优点，提取钩吻生物碱含量在50％以上。

2、为了实现上述技术目的，本发明提供了一种基于响应面法优化提取钩吻生物碱的方法，包括以下步骤：

3、1)对钩吻进行粉碎处理，得到钩吻粉末；

4、2)以乙醇为提取溶剂对钩吻粉末进行超声提取，并以浸润时间、乙醇浓度和提取时间三个单因素设计单因素实验；

5、3)以总生物碱od值为指标，对浸润时间、乙醇浓度和提取时间三个因素进行考察，利用box-behnken对试验进行三因素三水平的响应面法优化，得到总生物碱吸光度值与乙醇浓度值、提取时间值和浸润时间值三个考察因素进行多项式拟合回归，得到回归方程式；

6、4)对回归方程式进行计算，得到提取钩吻生物碱的最佳提取工艺条件；

7、5)在最佳提取工艺条件下对钩吻进行生物碱提取。

8、本发明利用响应面法对钩吻生物碱的提取工艺进行优化，以总生物碱吸光度值即od值为指标，对乙醇浓度、提取时间和浸润时间三个因素进行考察，利用box-behnken对试验进行三因素三水平的响应面法优化，得出了一种提取优化钩吻生物碱的方法，有效避免了正交试验精度不够的缺点，且可保证提取的科学性和稳定性。本发明利用响应面法优化钩吻提取纯化，将复杂的多元关系可视化为简单的二维或三维图，并使用较少的试验次获得对因变量影响因素的有效信息具有高效和低成本的优势。该方法所提出的工艺科学、合理，具有安全可靠和收率高的优点，通过该方法提取得到的钩吻生物碱含量在50％以上。

9、作为一个优选的方案，所述回归方程式为：

10、y＝1.576608-0.144385a+0.2380925b+0.0136575c-0.182235ab-0.106975ac-0.00399bc-0.268809a2-0.452144b2-0.122474c2；

11、式中y为钩吻总生物碱od值，变量参数a为乙醇浓度，b为提取时间，c为浸润时间。

12、根据回归方程可以看出，提取时间的二次项(b2)对钩吻生物碱od值影响最大。乙醇浓度(a)、乙醇浓度和提取时间的交互项(ab)和提取时间(b)对钩吻生物碱od值影响较大。

13、作为一个优选的方案，所述单因素实验的提取方法为：将钩吻粉碎过筛，以氢氧化钠水溶液浸润，再加入乙醇进行超声提取，取提取液进行旋蒸除醇后加入盐酸发生酸碱反应，静置，抽滤，得到含钩吻生物碱的滤液；所述含钩吻生物碱的滤液用调节ph值至11～12，加入乙酸乙酯进行萃取。

14、本发明提取的原理是：通过将钩吻药粉浸渍，使溶剂充分渗透扩散；超声波在传输过程中，会产生压缩波和剪切波，使介质在其作用下产生微小振动。这种微小振动使分子之间的化学键断裂，导致物质分离、散布和溶解，从而实现物质的提取和分离，所以提取效果比较好；之后，在适当浓缩乙醇后，加酸让生物碱成为生物碱盐而溶于水，与水不溶性的杂质分开；然后调节ph值至11～12，碱化生物碱，使生物碱游离；最后，利用生物碱溶于乙酸乙酯的特性去掉杂质，浓缩乙酸乙酯，得总生物碱。

15、作为一个优选的方案，所述钩吻与氢氧化钠的质量比为1:(4～6)；所述氢氧化钠配置成水溶液使用，其质量分数为3.0～4.0％。

16、作为一个优选的方案，所述超声提取具体为：加入乙醇溶液进行超声提取后静置，取上清液再次加入乙醇溶液进行超声提取。

17、作为一个优选的方案，所述超声提取时钩吻和乙醇的固液比为：1g:(10～14)ml，超声频率为35～50khz。

18、作为一个优选的方案，所述盐酸的摩尔浓度为2.5～3.5mol/l。在此浓度下，钩吻生物碱溶液中的水不溶性杂质可以更好的被去除。

19、作为一个优选的方案，所述单因素实验中乙醇浓度为60～90％。在乙醇浓度为80％时，生物碱od值达到最大值；当乙醇浓度大于80％时，od值反而下降。这是因为乙醇浓度与钩吻生物碱的极性有关，当二者极性接近时，有利于生物碱溶解到溶剂中，使得od值增大，但当乙醇浓度过大时，溶剂的极性过小，反而使得生物碱的od值下降。

20、作为一个优选的方案，所述单因素实验中提取时间为0.5～1.25h。在提取时间为0.5～1h时，随着提取时间的延长，生物碱od值也增大，1h生物碱含量达到最大值,是因为提取时间的延长，增加了溶剂与钩吻之间的渗透时间，使得生物碱od值增大；后续1.25h时，与1h相比下降一些。

21、作为一个优选的方案，所述单因素实验中浸润时间为12～30h。在12～30h，od值逐渐增大，这是由于氢氧化钠浸泡使钩吻中有效成分更好地渗出。

22、作为一个优选的方案，所述最佳提取工艺条件为乙醇浓度为86％，提取时间为62min，浸润时间为23h，钩吻和乙醇的固液比为1g∶11ml。

23、与现有技术相比，本发明的技术方案带来的有益技术效果：

24、本发明利用响应面法对钩吻生物碱的提取工艺进行优化，以总生物碱od值为指标，对浸润时间、乙醇浓度和提取时间三个因素进行考察，利用box-behnken对试验进行三因素三水平的响应面法优化，得出了一种提取优化钩吻生物碱提取物的方法，有效避免了正交试验精度不够的缺点，且可保证提取的科学性和稳定性。本发明利用响应面法优化钩吻提取纯化，将复杂的多元关系可视化为简单的二维或三维图，并使用较少的试验次数，可获得对因变量影响因素的有效信息，具有高效和低成本的优势。该方法所提出的工艺科学、合理，具有安全可靠和收率高的优点，通过该方法提取得到的钩吻生物碱含量在50％以上。