基于矢量运算的胶原纤维和细胞间三维相对取向计算方法

本发明属于生物组织的定量表征与图像分析，具体涉及一种基于矢量运算的胶原纤维和细胞间三维相对取向计算方法。

背景技术：

1、二次谐波产生(second harmonic generation,shg)显微成像技术是一种基于二次谐波这一非线性光学特性的成像技术，对具有高非线性极化率、非对称性中心结构的胶原纤维能够实现高分辨率、深穿透性、非侵入性和低损伤的无标记成像，因此在胶原纤维成像中具有较大优势。双光子激发荧光(two-photon excited fluorescence,tpef)是一种基于双光子吸收过程这一非线性光学特性的显微成像技术，利用超短激光脉冲快速扫描样品获取待测样品三维结构图像信息，具有低损伤、高成像深度、低干扰、低光漂白的优势，可以用来对细胞进行三维成像。

2、纤维状结构是生物组织的一种基本结构形式，在生命活动中起到重要作用，胶原纤维等以纤维状结构的形式存在于生物体内。生物组织的损伤和愈合、疾病的发生和发展以及癌症的发生和转移等，往往与细胞和细胞外基质(主要是胶原纤维)相互作用的扰动密切相关。

3、胶原纤维的二次谐波产生显微成像结果包含着胶原纤维空间形态、结构和分布的丰富信息。当前，已有部分参量用于描述胶原纤维的取向有序性、曲率特征、局域密度等空间特征，目前已被广泛应用于生物医学和生命科学领域。同时，也有针对诸多生理变化中细胞特征的分析，例如对线粒体群簇的特征分析、对氧化还原率的分析等等。但这些定量特征仅仅针对单一的胶原纤维或者细胞，缺乏将两者的空间分布特征相结合的定量分析，忽视了它们的相对变化，尤其难以体现胶原纤维和细胞的相对空间分布的细节信息，无法充分揭示细胞和细胞外基质之间的相互作用。

4、目前针对胶原纤维与细胞的相对位置的分析，主要依靠病理学家按照经验，人工进行定性评估，结果缺乏足够的细节鉴别力，偶然性较大。也有研究者使用在二维的病理学组织切片图像上通过计算胶原纤维彼此之间的相对方向来替代描述胶原纤维与细胞之间的相对分布，结果有一定参考性，但在细节上无法充分代表二者之间的相对分布，缺乏对三维结构的揭示。综上所述，目前亟需能够定量描述胶原纤维和细胞的相对位置空间分布特征，即三维相对取向的方法。

技术实现思路

1、鉴于上述，本发明提出了一种基于矢量运算的胶原纤维和细胞间三维相对取向计算方法。该方法能够反映胶原纤维和细胞的三维相对位置的空间分布特征，具有快速、简洁、精确、适用性强等优点。

2、一种基于矢量运算的胶原纤维和细胞间三维相对取向计算方法，使用三维相对取向参量来定量表征胶原纤维与细胞的相对位置与空间分布，将胶原纤维和细胞的形态和结构特征相结合进行分析，拓展对细胞和细胞外基质空间特征的描述，包括以下步骤：

3、1)对获得的三维数据中每张二维胶原纤维图像进行阈值化处理，获得胶原纤维图像二值化矩阵，组成胶原纤维图像三维数组；

4、2)对获得的三维数据中每张二维细胞图像进行阈值化处理，通过膨胀、孔洞填充、求最大连通域和骨架化的操作进行细胞轮廓提取，获得细胞图像二值化矩阵，组成细胞图像三维数组；

5、3)使用胶原纤维图像三维数组，计算胶原纤维图像的像素级三维空间取向，获得图像中所有像素的三维空间方向θfiber和

6、4)基于细胞图像三维数组，进行细胞轮廓的三维拟合，获得三维拟合方程，计算细胞轮廓上每点处法线向量的三维空间方向θnormal和

7、5)对胶原纤维图像三维数组中的每个像素点，寻找对应细胞轮廓上距离其最近点的像素，基于此两点的三维空间方向θfiber、θnormal和计算两者三维空间方向之差，取其余角即为对应的三维相对取向；

8、6)计算三维相对取向的平均值，定量描述胶原纤维和细胞之间空间相对位置的整体特征，并按照计算得到的三维相对取向数值对图像进行伪彩色编码来可视化胶原纤维和细胞的空间相对位置分布特征。

9、作为进一步地改进，本发明所述的步骤5)中，基于三维空间方向θfiber、θnormal和计算两者三维空间方向之差方法如下：

10、

11、其中，δθ＝cos(θfiber-θnormal)＝cos(θnormal-θfiber)，δ取值范围为[0°，90°]。三维相对取向为90-δ，取值范围为[0°，90°]，当胶原纤维越垂直于细胞轮廓排列，三维相对取向数值越接近于90°，当胶原纤维越平行于细胞轮廓排列时，三维相对取向数值越接近于0°。

12、作为进一步地改进，本发明所述的步骤4)中，计算每点处法线向量的三维空间方向θnormal和具体为：以轮廓上给定像素点(x0,y0,z0)为该点处空间坐标系原点，与胶原纤维三维空间方向的θ和定义相同，θ定义为其在xy平面的投影与+x方向的夹角，投影向量为+x轴方向向量为根据向量夹角计算公式获得cosθnormal如下：

13、

14、根据反余弦计算得到θnormal值，同样地，则定义为法线向量与-z方向的夹角，-z轴方向向量为(0,0,-1)，最终计算得到值。

15、作为进一步地改进，本发明所述的步骤4)中，法线向量通过以下数学推导表达式获得：

16、每点空间坐标(x0,y0,z0)已知，直接对拟合方程f(x,y,z)＝0求偏导后，计算得到x的偏导数：fx'(x0,y0,z0)，对y的偏导数：fy'(x0,y0,z0)，对z的偏导数：fz'(x0,y0,z0)。

17、在三维空间中，曲面的法线向量是与曲面在该点处的切平面垂直的向量，对于曲面f(x,y,z)＝0，以指向轮廓外方向为正方向，在点(x0,y0,z0)处的法线向量为：

18、

19、作为进一步地改进，本发明所述的步骤3)中，胶原纤维图像其三维方向由方位角θ和极角定义，两者均从0°到180°变化，极角进一步由方程得到：

20、

21、其中，β和γ是引入的两个方位角来表征极角对于三维空间中的任一纤维，其方位角θ定义为其在xy平面的投影与+x方向的夹角，而极角则定义为该纤维与-z方向的夹角，其中，θ和的取值范围均为[0°，180°]；

22、具体来说，为获取给定像素的三维方向，首先在该像素周围创建一个n×n×n的三维评估窗口，生成所有通过窗口中心像素的所有矢量，这些矢量由w1和w2进行加权：

23、

24、w1用矢量长度l的倒数对矢量加权，w2根据强度变化对矢量加权，其中a1，a2，a3是中心像素以及沿向量方向与该中心像素对称的两个像素的强度，而是这三个像素强度的平均值，中心像素的方位角方向被定义为所有加权向量之和的方向，在确定了这三个方位角之后，即可获得三维方向。

25、作为进一步地改进，本发明所述的步骤5)中，对胶原纤维图像三维数组中的每个像素点，寻找对应细胞轮廓上距离其最近点的像素，其方法为：对于胶原纤维上点(x1,y1,z1)，遍历细胞轮廓上每点(x,y,z)使用距离计算公式，距离取使d最小对应的细胞轮廓上像素点。

26、本发明与现有技术方案相比，具有如下优点：

27、1.本发明通过对使用二次谐波产生显微成像获得的三维图像堆栈进行分析与结构特征提取，相比现有的组织病理学方法，有着高精度、快速无创以及节省人力物力的优势，同时能够实现对小病灶的成像。

28、2.本发明所提出的方法可以对三维图像进行处理，相对于背景技术中局限于胶原纤维之间的二维相对方向的计算而言，本发明提出的方法可以更完整地分析三维图像中纤维状组织的三维方向，并进一步计算其与细胞之间的三维相对取向，体现其与细胞之间的三维相对位置分布特征，而非局限于胶原纤维之间的相对位置分布特征，应用场景十分广泛。本发明方法可以实现对生物组织更加全面与完整的理解，对于生理特征变化的研究与分析有着深远的意义。

29、3.与背景技术中仅描述胶原纤维三维空间特征的技术相比，本发明不仅计算胶原纤维的空间方向用于描述胶原纤维的空间分布特征，同时引入对细胞轮廓上每点空间方向的特征提取，通过计算得到胶原纤维与细胞的三维空间中的相对位置，有利于同时分析生理变化中胶原纤维与细胞所产生的空间分布特征变化。

30、4.本发明计算获得的三维相对取向平均值，能够定量比较生理变化中胶原纤维和细胞间整体空间相对位置的变化，此数值具有明确的科学意义，可帮助研究人员迅速掌握变化的趋势和特征，有助于提高后续研究效率，确定研究方案。

31、5.本发明获得的三维相对取向分布特征，可视化提供了像素级别分辨率的量化信息，所使用的伪彩色编码技术能够通过不同颜色更加清晰地展示不同的空间相对位置分布特征，更加生动形象，使得这些信息更加容易被使用者所获得，与背景技术相比拥有更强的信息可读性。