用于评价临床不育的方法和系统的制作方法
【专利说明】用于评价临床不育的方法和系统
[0001]本申请是申请日为2009年1月7日、申请号为"200980133799. 9"、发明名称为"用 于评价临床不育的方法和系统"的发明专利申请的分案申请。
[000引交叉引用
[0003] 本申请要求2008年7月1日提交的美国临时专利申请号61/077, 439和2008年7 月17日提交的美国临时专利申请号61/081，596的权益，运些申请通过引用全文并入本文。
[0004]政府权益
[0005]本发明在美国国家卫生研究院给予的联邦政府拨款第R01GM067250和R01 皿057970号的政府支持下进行。美国政府对本发明有某些权利。
[000引发明背景
[0007] 生殖失败是严重的问题，临床上已通过各种辅助的生殖技术包括体外受精（IVF) 和胚胎移植巧T)来解决。由于体外受精提供了在形态学水平表现正常的胚胎用于移植到 完全易感的接受者，可能预料运些程序产生极其高的受孕率。尽管有运些努力，IVF/ET的成 功率低于理想。在1994年美国和加拿大公布的IVF/ET数据中，开始了 26,961个标准IVF 周期。其中，86. 2%达到采集，其中的90. 2%达到移植。然而，在临床妊娠方面，总成功率是 每个开始的周期22. 7%，每次移植29. 1 %的妊娠率。
[0008] 另外，在体外受精之后似乎有早期妊娠丢失的高发生率，生化妊娠率是18%，自然 流产率是27%。因此，看起来IVF技术已被充分优化，但植入失败可能是进行ET的大量丢 失的原因，运种围植入丢失是可能改进的领域。各种辅助的生殖技术的成功率的关键因素 是子宫内膜容受性，运是一种必须与胚胎发育至植入-感受态的胚泡协调的过渡态。
[0009]IVF是一种昂贵的程序，对于患者来说在屯、理学上可能是创伤性的。需要外科手 术来从IVF的女性收集卵子，在受精之后，需要进一步的外科手术来在子宫中植入受精卵。 然后接受者必须等待一段时间才能确定是否已建立起妊娠。在一些病例，可能尽管重复多 次努力而不能实现妊娠，运些病例可能对患者和社会在财务和人力两方面造成相当大的花 费。
[0010] 因此，尽管可改进IVF的成功率，可能期望的是能够在治疗前鉴定IVF不太可能成 功的接受者，从而使运些患者能够避免W上提到的IVF程序的花费和创伤。
[0011] 本发明解决了运些需要。
[001引发明概述
[0013] 提供了用于便于评价临床不育的方法和基于计算机的系统。可实施所述方法和系 统W，例如，便于为体外受精治疗周期评价受治疗者，包括确定活产事件概率。可实施所述 方法和系统W，例如，便于确定胚胎的成功植入、选择将移植的胚胎的最佳数目、确定在不 成功的治疗周期之后随后体外受精治疗周期的成功。
[0014]本领域技术人员阅读W下更完全地描述的本发明细节之后，本发明的运些和其它 目标、益处和特征将变得明显。
[0015] 附图简述
[0016] 当结合附图阅读时，最佳地从W下详述理解本发明。需要强调的是，根据一般实 践，图的各个特征不是按比例的。相反，为了清楚，各个特征的大小是任意放大或缩小的。附 图中包括W下各图。
[0017]图1显示数据的来源。图A显示在2005年进行的IVF周期。图B显示在665个 新的、非供体IVF周期中卵母细胞和胚胎的利用。图A中的所有数目表示周期的数目，图B 中的数目表示卵母细胞或胚胎的数目。新的周期由在同一周期中进行的促性腺素卵巢刺激 和胚胎移植来界定；冷藏周期利用从之前的周期获得和冷藏的胚胎；"全冷冻"是其中由于 医学或非医学原因，在同一周期中进行卵巢刺激，但胚胎被冷藏而不是被移植回的周期。由 于多种医学和非医学原因未达到新鲜胚胎移植，从分析中去除157个周期。
[001引图2显示根据在第3天的细胞数目，来自665个新的、非供体IVF病例的所有胚胎 的分布。
[0019] 图3显示变量和其在确定A) 8细胞胚胎数（图A)、第3天FSH(图B)和胚胎总数 (图C)时的相对重要性。
[0020] 图4显示细胞周期蛋白A2被Ccna2-M0翻译阻滞，导致胚胎在2-细胞期停滞。图A 显示通过RT-PCR在1-至2-细胞胚胎中的Ccna2表达。图B显示核细胞周期蛋白A2定位 在83. 4 + 6. 0%Ccna2-M0-注射的胚胎中不存在，但在所有未注射胚胎中存在；P< 0. 01)。 图C显示~50kD细胞周期蛋白A2蛋白在Ccna2-M0-注射的胚胎中未检测到。
[0021] 图5,图A显示与对照相比，Ccna2-M0诱导更高比率的2-细胞期停滞（P< 0. 01)。 图B显示只有1. 8 + 1. 8%Ccna2-M0-注射的胚胎达到胚泡期（与Ccna2-MM相比P= 0. 06)。 图C显示2-细胞期停滞比率随着Ccna2-M0浓度减少（0. 5mM的P= 0. 05 ;0. 25mM的P= 0. 01)。图D显示在0. 25mM比在0. 75mM胚泡发育比率更高（p<0. 001)。所有的柱和误差 棒代表分别来自至少3个独立实验组的平均值±s.e.m.。比例尺是40ym。参见表1使用 的所有M0的祀向序列，表7是在每组实验中检验的胚胎总数。
[0022] 图6显示在最早阶段调节哺乳动物胚胎发育的机制。在野生型（+/-)胚胎中，在 胚胎基因组激活巧GA)之前存在母体转录物，而在母体-胚胎过渡阶段存在母体转录物和 胚胎转录物，运二者导致产生正常基因产物（图A)。在从对无效突变杂合（+/-)的母体产 生的纯合无效突变（-/-)胚胎中，持续的母体转录物和/或蛋白可能"捶救"或延迟表型出 现（图B)。相反，在从纯合突变女性或带有卵母细胞-特异性基因缺失的女性产生的纯合 无效突变胚胎中，观察到的缺陷可能反映卵母细胞缺陷，而不是早期胚胎中的特异性基因 需求（图C)。因此，当母体和早期胚胎转录物二者可能同时存在时，运些策略不解决特异 性基因在EGA尖点或在EGA期间的精确作用。在EGA时或EGA之前细胞质微注射反义吗嘟 代寡核巧酸（M0)到野生型胚胎中导致母体和胚胎基因转录物二者的特异性翻译阻滞（图 D)。因为M0持续至少数个细胞分裂周期，基因-特异性翻译阻滞可能直到桑甚胚-胚泡期 都有效。在运些发育阶段期间基因产物的不存在将掲示关键的基因功能和暴露早期表型， 运是在常规基因-祀向策略中通过同源重组和基因转置可能不可检测的。尽管在其它物种 中已充分建立此模型，其将示例从考察胚胎基因的功能转化为考察基因产物的功能而不论 其母体或胚胎来源。
[0023] 图7显示实验策略。从野生型交配收集在2前核（2PN)或1-细胞期的胚胎，并注 射设计为祀向特定基因的反义吗嘟代寡聚物（M0)。M0结合于5'UTR或转录起始位点并通 过空间位阻阻滞翻译。体外培养微注射的胚胎和未注射的对照胚胎，观察发育表型诸如在 2-细胞、4-细胞、多细胞或桑甚胚阶段碎裂或停滞。如果基因-特异性MO-致地产生相同 表型，而错配对照M0允许正常发育，则目标基因的敲低由免疫细胞化学和/或免疫印迹法 验证。基因功能的机制通过从在mid-2-细胞期（HCG后43小时）的注射和对照胚胎获得 全体基因表达谱而进一步研究。检验候选下游基因在早期胚胎中的差异表达和基因功能。
[0024]图8显示通过单胚胎RT-PCR在小鼠合子中的0ct4表达。
[00巧]图9显示在形成胚泡之前早期胚胎发育需要0ct4。图A显示0ct4-M0-注射的胚胎 在多细胞期停滞，而对照达到胚泡期。图B显示0ct4敲低诱导在1-至多细胞期更高的停滞 比率；P<0. 01。图C显示0ct4-M0-注射的胚胎都不发育为胚泡。图D显示随着0ct4-M0 浓度，在1-至多细胞期停滞比率减少（P<0. 01)。图E显示随着减少浓度的0ct4-M0,有 更高比率胚泡发育的非显著趋势。
[0026] 图10显不在Oct4-M〇-注射的胚胎中在4-细胞期之前减少的0ct4表达是明显 的。0ct4信号在注射0ct4-M0的胚胎中不存在，但其核定位在未注射的对照和错配对照中 存在。比例尺是40ym。
[0027] 图11，图A显示核0ct4表达在0ct4-M0-注射的胚胎中不存在（上图），但在 0ct4-MM-注射的胚胎和未注射的胚胎中存在。图B显示与没有共注射或mEYFPmRNA共注射 相比，共注射36或3. 6ng/yL0ct4mRNA通过具体地减少在1-至多细胞期的停滞比率而导 致部分捶救0ct4-M0诱导的表型，运导致更高比率的胚泡发育（P<0. 01)。图C显示过表 达0ct4mRNAW剂量依赖性方式诱导更高的发育停滞，W使注射36或90ng/yL0ct4mRNA 后与过表达mEYFP相比胚泡比率显著降低（p<0. 01)。基因过表达通过q-PCR或免疫细胞 化学验证（数据未显示）。（比例尺是=40ym)。
[002引图12显示0ct4-M0-注射的胚胎中在多细胞期减少的0ct4表达。只有6. 4 + 3. 2% 0ct4-M0-注射的胚胎显示核0ct4信号，而88. 9± 11. 1 % 0ct4-MM-注射的胚胎和 82. 7 + 10. 9%未注射的对照胚胎在多细胞期显示明确的核0ct4表达；P< 0. 05。
[0029] 图13显示由0ct4E4-M0证实在早期胚胎发育中需要0ct4,0ct4E4-M0是祀向0ct4 的外显子4的剪接位点的反义吗嘟代。图A显示由两种吗嘟代0ct4-M0和0ct4E4-M0祀向 的位点。0ct4-M0祀向开始于ATG起始位点的25个核巧酸，而0ct4E4-M0祀向在第4个外显 子巧4)的内含子（I)-外显子似边界的剪接位点。预期去除E4会产生一种缺少DNA-结 合和活化结构域的蛋白产物。图B显示注射0ct4E4-M0的64. 6± 19. 9%的胚胎在2-细胞 期停滞，而注射错配对照0ct4E4-MM的胚胎都不在2-细胞期停滞。图C显示与错配对照 0ct4E4-MM相比，注射0ct4E4-M0之后胚泡发育严重受损。
[0030] 图14和15显示0ct4的基因调节。图14,图A显示3种0ct4敲低、3种Ccna2 敲低和6种未注射的（NI)汇集的胚胎样品的无监督聚类（unsupervisedclustering)，W 及增加（红色）和减少的（蓝色）基因表达。标尺是标准偏差。图14,图B显示差异表达 的基因在0ct4和Ccna2敲低胚胎中的交叉。图14,图C和图15显示通过单胚胎q-PCR的 0ct4敲低相对表达，图14,图C是过表达的基因（对化巧P< 0. 05)，图15是下调的基因 (*p<< 0. 001，林口< 0. 05,***p< 0. 1)。TR是翻译阻遏。误差棒表示S.e.m.。
[0031] 图16显示0ct4功能在1-至2-细胞期的模型。图A显示绝对（ACt)(红色）大于 其S.e.m.(蓝色）的基因，基于递增的S.e.m.顺时针地排列（对数标尺）。图B显示0ct4 经由转录和转录后机制对各模块提议的调节。
[0032] 图17显示活产分析的数据来源概述。框中的数目表示在Stan化rdIVF中屯、经 2003-06进行的新周期的数目。未包括的周期是关于：代孕母亲（gestationalcarriers)、 冷冻ET或冷藏胚胎移植（利用冷冻胚胎的周期，不论周期是在Stan化rd还是外面进行）、 供体卵母细胞（非自身卵母细胞）、接受者周期和其中不注射促性腺素的周期。因为重复的 条目和未知结果，从分析排除9个周期。取决于患者为了新的IVF周期返回的次数，分析的 周期进一步分为周期1、2、3或超过。
[0033] 图18显示活产结果的概述。不同的框代表C1(第一-IVF周期）、C2(第二-IVF 周期）和C3(第S-IVF周期）。每个框显示具有活产（LB+)或无活产（LB-)结果的周期数 目、分析的周期总数目（脚的百分比W及退出并没有返回的患者数目。
[0034] 图19是显示胚胎关于发育阶段的分布的图。来自所有=个周期的2969个新的、非 供体IVF病例根据在体外培养第3天的细胞数目的分布。每个胚胎的细胞数目和具有8个 细胞的胚胎的最大数目（~40%)在周期C1 (无填充图案）、C2(水平填充图案）和C3(垂 直填充图案）之间相似。
[003引图20显示预测模型和它们与典型IVF周期的时间关系。IVF周期包括利用口服 避孕药（0C巧下调内源促性腺素和月经周期、定期F甜注射、和W带有或不带有血清雌二醇 的超声波监控周期、然后是hCG注射W模拟内源LH波动、卵母细胞采集、由IVF或ICSI受 精、体外胚胎培养、胚胎移植、和低溫储存多余胚胎。=个黑色星形代表患者可获取关于进 一步治疗选择和是否继续治疗的知情决定的时间点。Pre-IVF模型继续直到治疗开始日。 Pre-OR(卵母细胞采集）模型继续直到hCG注射。化st-IVF模型包括直到胚胎移植的所有 变量。
[0036] 图214、218和21(：显示^个分析组的树模型：？'6-1￥。(214)、？的-01?(218)和 化st-IVF(21C)。饼图显示活产（LB)在分析的周期总数目（脚中的百分比。最终人群标为 群1(Pop1)等等，并标出其活产率。
[0037] 图22显示2007年数据集的纳入和排除标准。
[0038] 图23显示Pre-IVF、Pre-OR和化st-IVF模型鉴定具有不同活产率的不同群。
[0039]图 24A、24B和 24C显示Pre-IVF(图 23A)、Pre-OR-(图 23B)、化st-IVF模型和基 于年龄的对照模型之间活产率的比较。
[0040] 图25显示化st-IVF模型C1群分配预测在C2中的不同活产率和在随后周期（C2 和C3)中的累计活产率。
[0041] 图26显示在1-细胞期进行的基因忍片实验结果。
[0042] 图27显示在4-细胞期进行的基因忍片实验结果。
[0043] 图28显示在8-细胞期进行的基因忍片实验结果。
[0044] 图29显示两个基因忍片实验的关联，显示一组基因在不同细胞期的表达。
[0045] 图30显示两个基因忍片实验的关联，显示一组基因在不同细胞期的表达。
[0046] 在描述本发明的实施方案之前，要理解的是，本发明不限于所描述的具体实施方 案，因为运些当然可W变化。还需要理解的是，在本文使用的术语仅用于描述特定实施方案 的目的，不意为限制性的，因为本发明的范围将仅由附随的权利要求书限定。
[0047] 当提供数值的范围时，要理解的是，除非上下文明确地相反说明，否则在所述范围 的上限和下限之间的每个中间值，直到所述下限的单位的十分之一，也具体地公开了。在提 及的范围内任何提及的值或中间值与在提及的范围内任何其它提及的值或中间值之间的 每个更小的范围包含于本发明的范围内。运些更小的范围的上限和下限可W独立地包括或 排除在所述更小的范围之内，且上限和下限的之一、无一或二者包括在所述更小的范围之 内时的范围也包含于本发明的范围内，并受在所提及的范围内特别排除任何值的限制。当 提及的范围包括两个限值之一或二者时，排除了所包括的限值之一或两者的范围也包括在 本发明的范围之内。
[0048] 除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语与本发明所属技术领域 普通技术人员通常所理解的含义相同。尽管类似于或等同于在本文描述的任何方法和材料 可W用于本发明的实践或试验，但现在描述了一些可能的和优选的方法和材料。在本文中 提及的所有出版物在此通过引用并入本发明，来公开和描述与所述出版物所引用的相关的 方法和/或材料。应理解的是，当本发明公开与并入的出版物的任何公开存在矛盾时，W本 发明公开为准。
[0049] 必须注意的是，在本文使用的和在附随的权利要求书中，除非上下文中有明确的 相反说明，否则单数形式"一（a)"、"一（an)"和"该（the)"包括了复数的指称对象。因此， 例如，提及"一个细胞"包括多个运样的细胞，提及"该化合物"包括提及一种或多种化合物 和本领域技术人员已知的其等价物，等等。
[0050] 进一步注意，权利要求可W撰写成排除任何任选的元素。因而，运一声明旨在充当 先行的基础，用于与权利要求元素的叙述一起来使用排他性术语如"单独地"、"仅"等等，或 用于"否定的"限制。
[0051] 本文讨论的出版物仅为了其在本申请提交日之前的公开而被提供。此处不应解释 为一种承认，即承认本发明没有权利凭借在先发明而先于上述出版物。进一步的，所提供的 出版物的日期可能不同于实际的出版日期，其可能需要被独立地确认。
[005引定义
[0053] 术语"受治疗者"、"个体"和"患者"在本文可互换地使用，指被评价治疗和/或正 被治疗的哺乳动物。在一个实施方案中，哺乳动物是人类，诸如女人。因此，术语"受治疗 者"、"个体"和"患者"涵盖需要评价临床不育的个体，包括已经经历体外受精周期或正候选 体外受精周期的个体。
[0054] 本文所用的术语"相关"或"与...相关"和类似术语是指两次事件的实例之间统 计相联，其中事件包括数目、数据集等等。例如，当事件包括数目时，正相关（在本文还称为 "直接相关"）表示当一个增加时，另一个也增加。负相关（在本文还称为"逆相关"）表示 当一个增加时，另一个减少。
[00巧]"生物样品"涵盖从个体获得的多种样品类型。该定义涵盖血液和生物来源的其它 液体样品、实体组织样品诸如活检样本或来源于其的组织培养物或细胞及其后代。该定义 还包括在取得后已通过任何方式操纵的样品，诸如通过试剂处理；洗涂；或富集某些细胞 群诸如癌细胞。该定义还包括已经富集特定类型分子如核酸、多肤等等的样品。术语"生物 样品"涵盖临床样品，并还包括通过外科切除获得的组织、由活检获得的组织、培养的细胞、 细胞上清液、细胞裂解物、组织样品、器官、骨髓、血液、血浆、血清等等。"生物样品"包括从 患者子宫获得的样品，包括胚胎培养物。
[0056] 术语"基因产物"和"表达产物"在本文提及基因时可互换地使用，是指基因的RNA 转录产物（转录物），包括mRNA和运种RNA转录物的多肤翻译产物，无论所述产物是否在翻 译后被修饰。术语"基因产物"和"表达产物"在本文提及RNA，特别是mRNA时可互换地使 用，是指运种RNA的多肤翻译产物，无论所述产物是否在翻译后被修饰。基因产物可W是， 例如，未剪接的RNA、mRNA、剪接变体mRNA、多肤、翻译后修饰多肤、剪接变体多肤等等。
[0057]本文所用的术语"标准化的表达水平"是指响应指示基因相对于参考基因的表达 产物水平的表达水平。
[0058]本文所用的术语"标记"和"检测标记"是指能够被检测的分子，其中所述分子包 括但不限于，放射性同位素、巧光剂（巧光团）、化学发光剂、生色团、酶、酶底物、酶辅因子、 酶抑制剂、生色团、染料、金属离子、金属溶胶、配体（如，生物素、亲和素、链霉亲和素或半 抗原）、嵌入染料及类似物。术语"巧光剂"或"巧光团"是指能够在可检测的范围表现巧光 的物质或其部分。
[0059]本文所用的术语"祀核酸区"或"祀核酸"是指带有将被检测（如，在包括核酸杂交 和/或扩增的方法中）的"祀序列"的核酸。祀核酸可W是单链或双链的，可W包括或不包 括祀序列W外的其它序列（如，祀核酸可W包括或不包括上游的核酸序列或5'侧翼序列， 可W包括或不包括下游或3'侧翼序列。当检测是通过扩增时，祀序列W外的运些其它序列 可与祀序列一起扩增或不与祀序列一起扩增。
[0060]本文所用的术语"引物"或"寡核巧酸引物"是指当放置在其中诱导引物延伸产物 合成的条件下时，作用为起始互补核酸链合成的寡核巧酸，如，在存在核巧酸和聚合诱导剂 诸如DNA或RNA聚合酶并在合适溫度、pH、金属离子浓度和盐浓度时。引物通常为与其在合 成引物延伸产物中的用途相适合的长度，长度可W在约8个核巧酸至约100个核巧酸（nt) 的范围，诸如约lOnt至约75nt、约15nt至约60nt、约15nt至约40nt、约18nt至约30nt、 约20nt至约40nt、约21nt至约50nt、约22nt至约45nt、约25nt至约40nt、等等，如，长度 在约18nt至约40nt、约20nt至约35nt、约21至约30nt的范围（包含性）、和在所提出范 围之间的任何长度。引物可W在长约10-50个核巧酸的范围，诸如约15-45、约18-40、约 20-30、约21-25nt、等等、和在所提出范围之间的任何长度。在一些实施方案中，引物长度不 超过约 10、12、15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65 或 70 个核 巧酸。在运样的上下文中，术语"约"可W解释为表示从5'或3'任一端或从两端多1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 个核巧酸。
[0061]在许多实施方案中，为了扩增的最大效率，引物是单链的，但可选地可W是双链 的。如果是双链，在许多实施方案中，在被用于制备延伸产物之前，引物首先被处理W分开 其各链。运一变性步骤通常通过加热实现，但可选地可W利用碱，随后中和来实现。从而， "引物"与模板互补，通过氨键合或杂交与模板复合，获得引物/模板复合体W起始由聚合酶 的合成，通过在其3'端共价加入碱基来延伸。
[0062]本文所用的"引物对"是指具有适于基于核酸扩增祀核酸的核酸序列的第一引物 和第二引物。运样的引物对通常包括具有与祀核酸第一部分相同或相似的序列的第一引 物、和具有与祀核酸第二部分互补的序列的第二引物，W提供祀核酸或其片段的扩增。除非 另外特别指明，否则本文提及"第一"和"第二"引物是随机的。例如，第一引物可设计为"正 向引物"（起始从祀核酸5'端的核酸合成）或为"反向引物"（起始从正向引物起始的合成 产生的延伸产物5'端的核酸合成）。类似地，第二引物可设计为正向引物或反向引物。
[0063] 本文所用的术语"探针"或"寡核巧酸探针"在本文可交换使用，是指包括如上定义 的多核巧酸的结构，含有与祀核酸分析物（如，核酸扩增产物）中存在的核酸序列互补的核 酸序列。探针的多核巧酸区域可包括DNA、和/或RNA、和/或合成的核巧酸类似物