一种提高微生物燃料电池产电性能的方法

1.本发明属于微生物电化学领域，更具体地，涉及一种提高微生物燃料电池产电性能的方法，该方法利用聚合物修饰技术能够从产电生物膜层面提升微生物燃料电池产电性能。


背景技术：

2.能源与环境问题是当今世界面临的两大课题。化石能源的使用伴随着能源的消耗和环境问题的产生，因此，开发和利用可清洁能源，同时解决环境问题，具有重要的意义。微生物燃料电池(microbial fuel cell，mfc)是一项集污水处理、产电、传感监测、绿色能源回收等应用功能的技术。通过在阳极表面附着产电微生物，产电菌代谢降解有机物的同时产生电子，电子通过电回路收集，从而实现mfc在产电领域的应用。微生物燃料电池在污水降解的过程中同时产电，能够解决污水处理厂耗电量太大的问题，具有良好的工程应用前景。
3.mfc产电效率主要受到产电菌与阳极之间的电子传递速率的影响，电子传递过程分为胞内电子传递和胞外电子传递两个步骤。胞内电子传递主要是指从电子供体传递到胞内末端电子受体(比如细胞外膜色素蛋白)之间的传递。胞内电子传递过程符合莫诺方程，必须从提高阳极生物膜中活性产电菌含量出发提高胞内电子传递速率。胞外电子传递是指电子从微生物外膜到阳极之间的传递，主要有三种传递方式。第一种是通过产电菌直接与阳极接触，通过产电菌细胞膜上具有氧化还原特性的蛋白质-细胞色素(比如c型细胞色素)进行的直接电子传递；第二种方式是通过产电菌分泌溶解性电子中介体(黄素，吩嗪等)进行间接电子传递；第三种方式是通过某些产电菌外膜纳米导线进行远程电子传递。微生物电化学系统的高电流密度是应用的基本，因此从提升电子速率传递出发提升mfc产电效率对mfc应用具有重要意义。
4.阳极产电生物膜是mfcs氧化有机物的生物催化剂，是mfcs实现电能回收，并利用电信号进行传感的根基。mfcs中的产电生物膜通常从环境中驯化富集，外部条件如流体形态、ph、温度、物质扩散等均会对阳极生物膜的数量、密度以及微生物种类产生显著影响。因此，现有研究大多通过研发新型载体材料，优化反应器构型及运行条件来提升mfc产电性能。但是以上方法都不能从根本上解决胞外电子传递速率限制的问题，阳极微生物的电子传递能力才是限制mfcs产电性能的主要因素。因此，需要寻找一种方法，从根本上调控产电生物膜电活性，提高mfc产电性能。
5.细胞表面修饰技术是指采用静电吸附、共价交联等方法将生物兼容的材料修饰在细胞表面，通过“人工造壳”来实现细胞表面功能化改造的一种技术。细胞表面修饰技术目前主要应用于生物医学、生物技术以及生物电子领域，通过修饰技术提高细胞的催化代谢能力或者抗环境压力能力。目前研究的修饰材料主要有矿物质(二氧化硅、二氧化钛、碳酸钙、水凝胶、聚合物、石墨烯、金属-有机配合物)等材料。


技术实现要素：

6.针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种提高微生物燃料电池产电性能的方法，其中通过在产电菌希瓦氏菌表面修饰导电聚合物聚吡咯和聚多巴胺，在提升产电菌胞外直接电子传递能力、缩短电子中介体电子传递的距离的同时，提升阳极表面粘附生物量，提高微生物燃料电池mfc的产电效率；与未经修饰的未修饰菌mfc相比，经过聚多巴胺和聚吡咯修饰的mfc输出电压是未修饰菌mfc的4.6倍，最大功率密度是未修饰菌mfc的11.8倍。本发明具有普适性、效果稳定等优点，提供了一种有效地提高了mfc产电性能的方法。
7.为实现上述目的，按照本发明，提供了一种提高微生物燃料电池产电性能的方法，其特征在于，该方法是采用生物兼容的手段在产电菌的表面依次修饰导电聚合物聚吡咯ppy和聚多巴胺pda，形成由内而外依次为产电菌、聚吡咯和聚多巴胺的pda@ppy@产电菌；其中，聚吡咯的修饰大大加速了电子传递速率，聚多巴胺的修饰提升了电极表面粘附生物量，且进一步发挥了聚吡咯对产电菌胞外电子传递能力的促进作用；利用所述聚吡咯和聚多巴胺修饰对生物膜特性的优化，提高微生物燃料电池mfc的产电效率。
8.作为本发明的进一步优选，所述采用生物兼容的手段在产电菌的表面依次功能性修饰导电聚合物聚吡咯ppy和聚多巴胺pda，具体是先向产电菌菌悬液中加入fe
3+
离子，接着加入吡咯，使吡咯在fe
3+
离子的催化作用下发生聚合，得到表面修饰有聚吡咯的产电菌；然后，向所述产电菌菌悬液中继续加入多巴胺，使多巴胺在表面已修饰有聚吡咯的产电菌上发生自聚合形成聚多巴胺。
9.作为本发明的进一步优选，所述fe
3+
离子具体是以fe(no3)3·
9h2o的形式加入至所述产电菌菌悬液中的，所述fe(no3)3·
9h2o在所述产电菌菌悬液中的浓度为5-15mmol/l，修饰时间为20-40min；
10.在吡咯的聚合反应发生前，所述吡咯在所述产电菌菌悬液中的浓度对应为0.6-1.2μl/ml，修饰时间为2-8h；
11.在多巴胺的自聚合反应发生前，所述多巴胺在所述产电菌菌悬液中的浓度对应为1-10mmol/l，修饰时间为10-30min。
12.作为本发明的进一步优选，所述fe
3+
离子具体是以fe(no3)3·
9h2o的形式加入至所述产电菌菌悬液中的，所述fe(no3)3·
9h2o在所述产电菌菌悬液中的浓度为7.5mmol/l，修饰时间为30min；
13.在吡咯的聚合反应发生前，所述吡咯在所述产电菌菌悬液中的浓度对应为0.88μl/ml，修饰时间为3h；
14.在多巴胺的自聚合反应发生前，所述多巴胺在所述产电菌菌悬液中的浓度对应为2mmol/l，修饰时间为15min。
15.作为本发明的进一步优选，利用所述聚吡咯和聚多巴胺修饰对生物膜特性的优化，提高微生物燃料电池mfc的产电效率，具体是将由内而外依次为产电菌、聚吡咯和聚多巴胺的pda@ppy@产电菌的菌悬液接种至微生物燃料电池mfc反应器内，经过mfc一个周期运行后产电菌在阳极表面成膜。
16.作为本发明的进一步优选，所述微生物燃料电池mfc，是在接种运行一个周期之后，将微生物燃料电池mfc的阳极液和阴极液更换为不含产电菌的阳极液和阴极液。
17.作为本发明的进一步优选，所述产电菌为希瓦氏菌。
18.通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，利用聚合物修饰产电菌，直接在产电菌表面修饰聚合物，利用修饰聚合物的导电性和高粘附性，使得产电菌胞外电子能力加强，同时通过提高阳极表面生物膜的量，最大程度上优化mfc产电性能。通过构建高电子传递效率的产电生物膜，直接从产电菌本身出发，从根本上提升了产电菌的胞外电子传递速率，解决了mfc产电效率由于胞外电子传递速率受限的问题。本发明具有普适性、效果稳定等优点，有效地提高了mfc产电性能，加快了mfc实际应用进程。
19.细胞表面修饰技术实现功能化应用的首要关键是修饰过程的生物兼容性，目前很多研究采用仿生原理进行修饰，受自然界生物的启发，以高度生物兼容性和功能化的方式构建人造壳调控细胞行为。本发明选用功能性的修饰材料，优化产电菌的胞外电子传递能力以及成膜特性，构建高电活性生物膜，以提高mfc产电性能。本发明利用聚吡咯的导电性提升产电菌胞外电子传递速率，但聚吡咯的修饰使得产电菌的粘附性下降，且希瓦氏菌本身较难成膜或成膜较薄，因此本发明利用聚多巴胺的高粘附性克服了这一缺点，这不仅有利于提高阳极表面的微生物量，还能够进一步发挥聚吡咯对产电菌的修饰作用，从而优化产电生物膜的电活性以及生物量，提高mfc的产电效率。本发明是采用生物兼容的手段在产电菌表面构建人工导电“细胞壁
”-
聚吡咯和聚多巴胺，其中，聚吡咯的修饰大大缩短了产电菌胞外电子传递的距离，加速了电子传递速率，聚多巴胺的修饰提升了电极表面粘附生物量，优化了产电菌(如希瓦氏菌)较难成膜的问题，且进一步发挥了聚吡咯对产电菌胞外电子传递能力的促进作用，从而有效地提升了mfc传感器产电性能。此方法具有普适性，能够应用于各种微生物体系，加速了mfc产电应用进程。
20.本发明所采用的修饰手段和材料均生物兼容，修饰过程不会对生物活性造成显著影响。本发明是先修饰导电聚合物聚吡咯ppy，再修饰聚多巴胺pda，例如可通过微生物静电作用吸附铁离子，并在细菌表面包裹一层聚吡咯之后再修饰聚多巴胺，不会对产电菌活性造成负面影响。并且，本发明采用层层(layer-by-layer)修饰的方法得到聚合物修饰产电菌，首先在产电菌表面修饰导电聚合物聚吡咯，再修饰一层聚多巴胺以提升产电菌在阳极表面的粘附性，最大程度优化聚吡咯的导电特性对产电生物膜的影响。本发明还进一步通过对加入聚合物单体的时间、浓度进行优选控制，能够在不影响产电菌活性的前提下，将聚合物修饰在产电菌(如希瓦氏菌)表面。
附图说明
21.图1是sem和tem表征图；图中，自左向右、自上向下的前3个子图分别对应未修饰菌、ppy@bacterial和pda@ppy@bacterial的sem图，后3个子图分别为未修饰菌、ppy@bacterial和pda@ppy@bacterial的tem图。
22.图2是聚合物修饰对产电菌活性影响图。
23.图3是mfc产电曲线图。
24.图4是本发明经过聚合物修饰处理得到的生物膜与常规未经过修饰处理得到的生物膜两者的对比结构示意图。
具体实施方式
25.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
26.总体来说，以产电菌为希瓦氏菌为例，本发明是通过在希瓦氏菌表面修饰聚合物聚吡咯和聚多巴胺，采用修饰后的产电菌接种mfc反应器，将其应用于mfc产电。可以通过分别采用未修饰菌(没有修饰)和修饰之后的希瓦氏菌接种mfc反应器，分析比较产电效率差异。
27.实施例
28.(ⅰ)产电菌的修饰：选用纯菌希瓦氏菌作为产电菌对象，采用层层修饰的方法，先通过静电吸附在产电菌表面吸附fe
3+
，优选的，fe(no3)3·
9h2o浓度为7.5mmol/l，修饰时间为30min；离心后重新悬浮，再在产电菌菌悬液中加入吡咯单体，优选的，吡咯单体浓度为0.88μl/ml，修饰时间为3h，通过fe
3+
的催化聚合，以在产电菌表面修饰聚吡咯，得到ppy@bacterial。进一步在菌悬液中加入多巴胺单体，优选的，多巴胺单体浓度为2mmol/l，修饰时间为15min，通过多巴胺的自聚合在产电菌表面修饰聚多巴胺层，得到pda@ppy@bacterial。
29.(ⅱ)sem/tem表征及活性表征：将未修饰菌(unmodified bacterial)、ppy@bacterial和pda@ppy@bacterial样品采用2％的甲醛过夜固定，再用灭菌的50mm磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline,pbs)清洗三遍后，分别采用25％，50％，75％，95％，100％(三次)梯度脱水，每次15min。将菌的酒精悬液滴在导电基底上，干燥，喷铂，上机进行sem测试。tem测试中将菌的酒精悬液滴在铜网上，干燥后上机测试。采用荧光光谱法定量分析聚合物修饰对希瓦氏菌活性的影响。标曲物质采用100％活细菌(采用没有经过任何聚合物修饰的希瓦氏菌)和100％死细菌(采用活细菌经过121℃高温灭菌20min之后的菌悬液)进行配制。将活死细菌用0.9％的nacl溶液清洗三次之后，稀释到菌密度为od600＝0.3左右，分别配比成活死比例为0％，10％，50％，90％，100％。采用live/dead baclight bacterial viability kits进行染色，染色液为1：1的syto 9：碘化丙啶混合染液，每3ml菌液加入9μl混合染液。避光染色30min后，上机测试。选择荧光光谱扫描模式，固定激发波长为490nm，扫描发射波长范围为490nm-700nm。分别计算荧光光谱曲线510nm-540nm(绿色荧光)及620nm-650nm(红色荧光)下的积分面积，利用已知不同比例的活死细菌比例以及该比例下绿色荧光与红色荧光强度的比值做图，即可获得标准曲线。未知样品的测定流程与标曲测定方法一致，将未修饰菌、聚吡咯修饰菌、聚吡咯和聚多巴胺双重修饰菌分别清洗，稀释，染色，荧光光谱扫描，获得的绿色荧光与红色荧光的比值，通过标曲计算获得活死细菌比例。
30.(ⅲ)mfc传感器的建立与启动：mfc反应器采用mfc双室瓶式反应器，瓶式反应器阳极室和阴极室体积分别为100ml，中间由质子交换膜隔开，优选的，阳极室和阴极室中间用nafion 117质子交换膜隔开；阳极和阴极材料为碳毡，尺寸为2cm
×
2cm
×
0.5cm；反应器外电路采用1000ω的电阻连接阳极和阴极。反应器组装好之后，将其置于高温灭菌锅中121℃高温灭菌20min后备用。lb培养基与pbs经氮气曝气20min后，再高温121℃高温灭菌20min。
矿物质溶液和维生素溶液经0.22μm滤膜过滤之后，再紫外灯照射30min。
31.分别将未修饰菌和修饰菌悬液分散在培养液中进行接种。培养液的配制采用5ml lb培养基，1g/l乙酸钠，1.25ml矿物质溶液，0.5ml维生素溶液，用100mm pbs定容成100ml。将未修饰菌和修饰菌菌悬液分别接种至mfc反应器内，经过一个周期(4-5天以上)接种成膜之后，再将mfc阳极液更换成不含有产电菌的纯培养液。阴极液的配制采用1.65g铁氰化钾(50mm)和0.75g氯化钾溶液溶于100ml pbs溶液中。阴极液注入阴极室后，用锡箔纸将阴极室包裹避光。电压的采集采用keithley数据采集仪，每10min记录一次数据。
32.实验结果分析
33.采用sem和tem表征聚合物修饰对细菌表面形态的影响，结果如图1所示。从sem图中可以看出，未修饰菌表面较为平滑，其表面的起伏可能是由于制样过程中梯度酒精脱水引起的。与未修饰菌相比，ppy@bacterial表面出现薄片状物质，说明聚吡咯的修饰过程的确会使菌体表面出现形态的差异。而经过聚多巴胺进行再修饰之后，细菌表面包裹的物质变厚，但包裹层表面较聚吡咯层平滑。聚多巴胺由于其丰富的活性基团，非常容易与材料表面共价交联。本发明中多巴胺的再修饰也是为了通过利用聚多巴胺的高粘附性，克服导电聚吡咯的弊端(较难粘附在材料表面)，从而充分发挥聚吡咯的导电优化特性。从tem结果中可以看出，未修饰菌表面非常光滑，而经过聚吡咯修饰后，希瓦氏菌表面包裹了一层聚合物，使其表面变得凹凸不平。而聚多巴胺的修饰使得整个菌体包裹在絮状聚合物中，将每一个菌通过絮状物连接在了一起。sem、tem图均表明聚合物的修饰会使希瓦氏菌菌体被聚合物包裹，表面形态发生明显改变。
34.修饰方法必须不影响细菌活性，采用细菌荧光染色标记再用荧光光谱仪进行活死细胞定量分析，结果如图2所示。以100％未修饰菌作为对照，从图中可看出，fe
3+
的修饰完全不会影响细胞活性。而经过3h吡咯聚合培养后，仅出现了少部分死细胞(1.89％)，说明吡咯聚合反应对细胞活性不会造成显著影响。再在聚吡咯修饰的细菌表面修饰多巴胺，死细胞含量上升至5.55％。总体来说，由于吡咯和多巴胺均生物兼容，且其聚合过程十分温和，因此并不会显著影响细菌活性。
35.采用纯菌mfc反应器采用接种运行一周期，再更换无菌培养液的形式运行。从图3中可以看出，pda@ppy@纯菌反应器最高输出电压为188mv左右，ppy@纯菌反应器最高输出电压为107mv左右，而未修饰菌反应器最高输出电压仅为58mv左右。当三组反应器输出电压均低于50mv后，更换无菌基质溶液。未修饰菌mfc反应器最高输出电压平台57mv左右，与接种周期相差不大。ppy@纯菌反应器最高输出电压为115mv左右，相对于未修饰菌反应器的2倍左右，聚吡咯能够加速微生物-电极之间的直接电子传递效率，并缩短间接电子传递的距离，从而提高mfc的产电效率。pda@ppy@纯菌反应器最高输出电压达265mv，且高输出电压持续时间增长，最高输出电压为未修饰菌mfc的4.6倍。极有可能是由于经一个周期的接种运行之后，经高粘附性pda修饰后的菌大量附着于电极表面成膜，改善了希瓦氏菌本身以及导电聚合物的修饰导致的较难吸附成膜的问题，因此能够更大程度上发挥导电聚合物聚吡咯的导电效应，大大提升了mfc的产电效率。
36.本发明中的微生物燃料电池mfc传感器各组件可市场购得，也可根据已有技术自行组建。本发明中的接种微生物来源为菌种保藏中心购买，由于此修饰方法具有普适性，来源还可以为稳定运行的mfc阳极液或污水处理厂进水。
37.上述实施例仅以希瓦氏菌为例，本发明方法具有普适性，可应用于各类产电菌。除了上述实施例中所采用的浓度与修饰时间外，浓度与修饰时间还可以根据实际情况灵活变化，例如，fe(no3)3·
9h2o的浓度还可以是5-15mmol/l范围内的其他值，对应的修饰时间也可以在20-40min范围内变化；吡咯单体的浓度也可以是0.6-1.2μl/ml范围内的其他值，对应的修饰时间可以在2-8h范围内变化；多巴胺的浓度可以是1-10mmol/l范围内的其他值，对应的修饰时间可以在10-30min范围内变化。
38.本发明中使用的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液。本发明中的氮气是纯度不低于99.99％的氮气。本实验使用的阳极为碳毡，也可使用碳布、石墨板、石墨棒等电极。mfc传感器除了上述实施例中的瓶式双室结构之外，还可以采用瓶式单室结构或者立方体单室结构。适用于本发明的缓冲溶液除了上述实验中使用的50mm和100mm的磷酸盐缓冲溶液之外，还可以用10-100mm的磷酸盐缓冲溶液。另外，除了上述实施案例中采用的乙酸钠作为碳源外，还可以采用葡萄糖、甲醇或碳水化合物类物质作为碳源。
39.本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。