测序仪成像对焦方法及装置、设备、存储介质与流程

1.本发明属于基因测序技术领域，具体涉及一种测序仪成像对焦方法及装置、设备、存储介质。


背景技术：

2.工作距离，指的是调准焦点时的物镜前缘与样品表面的距离。理论工作距离，指的是产品手册中对物镜说明时标注的工作距离。
3.在基因测序仪的应用领域，碱基识别是高通量基因测序的核心环节，它主要是指从含有碱基信息的荧光点图中获得基因序列信息。目前都是通过相机捕获荧光点图，但是每次拍摄的时候，荧光点的位置都会改变，都需要进行微小距离调整及成像质量实时判断，才能捕获清晰的图像。这种手动对焦的方式，使得测序仪的工作效率和准确度都比较低。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种测序仪成像对焦方法及装置、设备、存储介质，可以实现自动对焦，实时捕获不同样品的清晰图像，提高测序仪的工作效率和准确度。
5.本发明实施例第一方面公开一种测序仪成像对焦方法，包括：
6.对所述测序仪的物镜执行初始调焦过程，以确定目标位置；
7.控制所述物镜在所述目标位置对测序样品进行拍摄，获得目标图像；
8.确定所述目标图像中的多个荧光样品点；
9.将所述多个荧光样品点划分为清晰样品点、模糊样品点和错误样品点；
10.将清晰样品点数量、模糊样品点数量、错误样品点数量、各个所述荧光样品点的灰度值和边长作为输入数据，输入至预先构建好的清晰度评分模型，得到所述目标图像的清晰度评分；
11.若所述目标图像的清晰度评分小于评分阈值，对所述物镜执行重新调焦过程，以重新确定目标位置，并重复执行所述控制所述物镜在所述目标位置对测序样品进行拍摄获得目标图像的步骤，直至所述目标图像的清晰度评分大于或等于所述评分阈值；其中，所述重新调焦过程包括所述初始调焦过程的全部或部分步骤。
12.本发明实施例第二方面公开一种测序仪成像对焦装置，包括：
13.初始调焦单元，用于对所述测序仪的物镜执行初始调焦过程，以确定目标位置；
14.拍摄单元，用于控制所述物镜在所述目标位置对测序样品进行拍摄，获得目标图像；
15.确定单元，用于确定所述目标图像中的多个荧光样品点；
16.划分单元，用于将所述多个荧光样品点划分为清晰样品点、模糊样品点和错误样品点；
17.评分单元，用于将清晰样品点数量、模糊样品点数量、错误样品点数量、各个所述荧光样品点的灰度值和边长作为输入数据，输入至预先构建好的清晰度评分模型，得到所
述目标图像的清晰度评分；
18.重新调焦单元，用于在所述目标图像的清晰度评分小于评分阈值时，触发所述初始调焦单元对所述物镜执行重新调焦过程，以重新确定目标位置，直至所述目标图像的清晰度评分大于或等于所述评分阈值；其中，所述重新调焦过程包括所述初始调焦过程的全部或部分步骤。
19.本发明实施例第三方面公开一种电子设备，包括存储有可执行程序代码的存储器以及与所述存储器耦合的处理器；所述处理器调用所述存储器中存储的所述可执行程序代码，用于执行第一方面公开的测序仪成像对焦方法。
20.本发明实施例第四方面公开一种计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质存储计算机程序，其中，所述计算机程序使得计算机执行第一方面公开的测序仪成像对焦方法。
21.本发明的有益效果在于，所提供的测序仪成像对焦方法及装置、设备、存储介质，在对测序仪的物镜执行初始调焦过程以确定目标位置之后，控制物镜在目标位置对测序样品进行测序，在测序过程中，每当物镜拍摄获得目标图像时，都对目标图像进行清晰度评分，若目标图像的清晰度评分小于评分阈值，则对物镜执行重新调焦过程以重新确定目标位置，并重复执行拍摄目标图像进行清晰度评分的步骤，直至目标图像的清晰度评分大于或等于评分阈值；其中，重新调焦过程包括初始调焦过程的全部或部分步骤；基于此，可以实现实时自动对焦，即便在对同一测序样品进行测序的过程中，也可以保证一直捕获到清晰图像，更准确地识别碱基，因此可以提高测序仪的工作效率和准确度。
22.除此之外，通过预先构建清晰度评分模型，每当对目标图像进行清晰度评分时，只需要确定目标图像中的多个荧光样品点，并将多个荧光样品点划分为清晰样品点、模糊样品点和错误样品点；然后将清晰样品点数量、模糊样品点数量、错误样品点数量、各个荧光样品点的灰度值和边长作为输入数据，输入至清晰度评分模型，便可以快速计算得到目标图像的清晰度评分，进而提高自动对焦的速度及准确性。
附图说明
23.此处的附图，示出了本发明所述技术方案的具体实例，并与具体实施方式构成说明书的一部分，用于解释本发明的技术方案、原理及效果。
24.除非特别说明或另有定义，不同附图中，相同的附图标记代表相同或相似的技术特征，对于相同或相似的技术特征，也可能会采用不同的附图标记进行表示。
25.图1是本发明实施例公开的测序仪成像对焦方法的流程图；
26.图2是本发明实施例公开的荧光样品点的投影数据的示意图；
27.图3是本发明实施例公开的测序仪成像对焦装置的结构示意图；
28.图4是本发明实施例公开的电子设备的结构示意图。
29.附图标记说明：
30.301、初始调焦单元；302、拍摄单元；303、确定单元；304、划分单元；305、评分单元；306、重新调焦单元；401、存储器；402、处理器。
具体实施方式
31.为了便于理解本发明，下面将参照说明书附图对本发明的具体实施例进行更详细的描述。
32.除非特别说明或另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语与所属技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在结合本发明的技术方案以现实的场景的情况下，本文所使用的所有技术和科学术语也可以具有与实现本发明的技术方案的目的相对应的含义。本文所使用的“第一、第二
…”
仅仅是用于对名称的区分，不代表具体的数量或顺序。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本文所使用的“所述”、“该”为相应位置之前所提及或描述的技术特征或技术内容，该技术特征或技术内容与其所提及的技术特征或技术内容可以是相同的，也可以是相似的。毫无疑义，与本发明的目的相违背，或者明显矛盾的技术内容或技术特征，应被排除在外。
33.如图1所示，本发明实施例公开一种测序仪成像对焦方法，包括：
34.s1、对测序仪的物镜执行初始调焦过程，以确定目标位置。
35.步骤s1中，在对每一个新的测序样品进行测序之前，都需要执行初始调焦过程，以确定目标位置，目标位置即为最佳拍摄位置。初始调焦过程可以包括粗调焦步骤、中调焦步骤和细调焦步骤；其中，
36.s1.1、粗调焦步骤包括：确定物镜满足理论工作距离的理论位置，从位于理论位置上方的第一起点开始，控制物镜以第一指定步长每向下移动一次，拍摄获得一个样品图像，并对样品图像进行清晰度评分，直至样品图像的清晰度评分与粗调焦理想评分sa的接近度量值满足预设条件；根据粗调焦过程获得的多个样品图像的清晰度评分，确定出粗调焦过程最高分时物镜的第一位置。
37.其中，第一起点与理论位置的距离为第一距离，第一距离可以是x1毫米；第一指定步长可以是y1微米；接近度量值指的是样品图像的清晰度评分与粗调焦理想评分的接近程度，当接近度量值满足预设条件时，说明两者足够接近。可以采用样品图像的清晰度评分s
样
与粗调焦理想评分sa两者之间的比值或差值来指代接近度量值；若采用sa/s
样
来指代接近度量值，可以确定一个指定阈值为sa/0.95，当sa/s
样
小于或等于sa/0.95时，判定接近度量值满足预设条件；若采用s
样
/sa来指代接近度量值，可以确定一个指定阈值为0.95/sa，当s
样
/sa大于或等于0.95/sa时，判定接近度量值满足预设条件；举例来说，假设sa＝1，s
样
＝0.96，0.96大于0.95，因此接近度量值满足预设条件。
38.s1.2、中调焦步骤包括：从位于第一位置上方的第二起点开始，控制物镜以第二指定步长每向下移动一次，拍摄获得一个样品图像，并对样品图像进行清晰度评分，直至样品图像的清晰度评分s
样
与中调焦理想评分sb的接近度量值满足预设条件；根据中调焦过程获得的多个样品图像的清晰度评分，确定出中调焦过程最高分时物镜的第二位置。
39.其中，第二指定步长可以是y2微米，y2＜y1，第二起点与第一位置的距离为第二距离，第二距离可以是x2微米，小于第一距离，从而可以进行相比粗调焦更加精细的中调焦。
40.s1.3、细调焦步骤包括：从位于第二位置上方的第三起点开始，控制物镜以第三指定步长每向下移动一次，拍摄获得一个样品图像，并对样品图像进行清晰度评分，直至样品图像的清晰度评分s
样
与细调焦理想评分sc的接近度量值满足预设条件；根据细调焦过程获得的多个样品图像的清晰度评分，确定出细调焦过程最高分时物镜的第三位置；将第三位
置确定为目标位置；其中，第三起点与第二位置的距离为第三距离。
41.其中，第三指定步长可以是y3微米，y3＜y2，第三距离可以是x3微米，小于第二距离。
42.其中，sa＜sb＜sc，判断s
样
与中调焦理想评分sb、细调焦理想评分sc的接近度量值是否满足预设条件的方式，可以参照以上判断s
样
与粗调焦理想评分sa的接近度量值是否满足预设条件的方式，在此不作赘述。
43.在执行以上初始调焦过程之后，可以进一步根据粗调焦过程、中调焦过程和细调焦三个过程获得的多个样品图像的清晰度评分，确定测序过程中要用的评分阈值。比如，可以确定出粗调焦、中调焦和细调焦三个过程中的清晰度最低分作为评分阈值s0；也可以确定出粗调焦、中调焦和细调焦三个过程中的清晰度平均分作为评分阈值s0；也可以确定出粗调焦、中调焦和细调焦三个过程中的清晰度最高分；将清晰度最高分与指定系数的乘积作为评分阈值s0；其中，指定系数小于1，例如0.8。后续在测序过程中，则可以根据该评分阈值进行评估，若拍摄到的目标图像的清晰度评分大于或等于s0，不需要重新对焦；若清晰度评分小于s0，则需要重新对焦。
44.s2、控制物镜在目标位置对测序样品进行拍摄，获得目标图像。
45.其中，目标图像可以为测序过程中的荧光点图，在测序过程中，一般需要对测序样品进行多次拍摄，以捕获荧光点图。而在实践中发现，拍摄数次之后图像就会变得不清晰，需要对焦。因此，为了实时跟踪拍摄到的荧光点图是否清晰，以便及时对焦，可以对每次拍摄的目标图像都进行清晰度评分。对目标图像进行清晰度评分的方式可以包括以下步骤s3～s5。
46.s3、确定目标图像中的多个荧光样品点。
47.步骤s3中，可以先计算目标图像的每一个像素点的灰度值；将灰度值达到灰度阈值的像素点确定为荧光像素点；然后判断以荧光像素点为中心的九宫格域内的荧光像素点数量是否至少为二；若是，判定九宫格域内包括的所有荧光像素点连续，且属于同一个荧光样品点；若否，判定荧光像素点为荧光样品点的边界点；遍历目标图像的各个荧光像素点之后，获得多个荧光样品点。
48.其中，灰度值指的是黑白图像中像素点的颜色深度，在拍摄的荧光点图中，荧光的能量越大，灰度值越高。灰度值的范围一般从0到255，白色为255，黑色为0。灰度阈值，指的是区分荧光和背景的灰度界限，可由开发人员预先设置。若任一像素点的灰度值大于或等于灰度阈值，判定该像素点为荧光像素点；若任一像素点的灰度值小于灰度阈值，则判定该像素点为背景像素点，可以进行滤除，仅对荧光像素点进行分析，识别荧光样品点。若与任一荧光像素点相邻的8个像素点中，至少有1个是荧光像素点，则认定这些荧光像素点连续，且属于同一个荧光样品点，否则该荧光像素点为荧光样品点的边界点，遍历所有荧光像素点之后，可识别出多个荧光样品点。
49.比如，以荧光像素点a点为中心，在与a点相邻的8个像素点中，识别到b点也是荧光像素点，则判定a点和b点是连续的，a点和b点属于同一个荧光样品点，并继续以b点为中心进行识别，若在b点上识别到c点与其是连续的，则a点、b点和c点属于同一个荧光样品点，继续在c点上识别，一直连续下去。但假如在b点的时候识别不到有连续的点时，说明这个荧光样品点已经识别完毕。
50.s4、将多个荧光样品点划分为清晰样品点、模糊样品点和错误样品点。
51.步骤s4中，可以将各个荧光样品点投影到x轴和y轴，获得各个荧光样品点的投影数据；然后根据投影数据，确定出荧光像素点最多的一边的荧光像素点数量作为荧光样品点的边长。其中，荧光样品点的投影数据的示意图可如图2所示，图中从左往右的每一列的荧光样品点的边长分别为1、2、3、3、4。
52.进一步地，可以设置清晰阈值和模糊阈值，对荧光样品点进行分类。其中，清晰阈值指的是清晰样品荧光点的边长像素点数阈值；模糊阈值指的是模糊样品荧光点的边长像素点数阈值。
53.基于此，若任一荧光样品点的边长小于或等于清晰阈值，判定该荧光样品点为清晰样品点；若任一荧光样品点的边长大于清晰阈值，且小于或等于模糊阈值，判定该荧光样品点为模糊样品点；若任一荧光样品点的边长大于模糊阈值，判定该荧光样品点为错误样品点。
54.s5、将清晰样品点数量、模糊样品点数量、错误样品点数量、各个荧光样品点的灰度值和边长作为输入数据，输入至预先构建好的清晰度评分模型，得到目标图像的清晰度评分。
55.执行步骤s4之后，可以统计不同类型的荧光样品点的数量，即分别统计错误样品点、清晰样品点和模糊样品点的数量，获得清晰样品点数量、模糊样品点数量、错误样品点数量；以及，计算各个荧光样品点的灰度值和边长。
56.其中，在预先构建清晰度评分模型时，通过对训练集的样本荧光图像进行处理，获得样本荧光图像的清晰样品点数量、模糊样品点数量、错误样品点数量、各个荧光样品点的灰度值和边长作为输入数据，对清晰度评分模型进行构建训练。
57.步骤s4中，具体可以基于清晰度评分模型，根据清晰样品点数量、模糊样品点数量和错误样品点数量计算得到有效样品分数，根据清晰样品点数量、模糊样品点数量、错误样品点数量、各个荧光样品点的边长和平均灰度值计算得到有效样品对焦分数，根据荧光样品点的最高灰度值和平均灰度值计算得到灰度分数；将有效样品分数、有效样品对焦分数、灰度分数相乘计算得到目标图像的清晰度评分。如此，通过对荧光样品点进行分类，结合清晰样品点数量、模糊样品点数量、错误样品点数量进行清晰度评分，可以提高清晰度评分的准确度。
58.s6、判断目标图像的清晰度评分是否小于评分阈值。若是，执行步骤s7，再转向步骤s2；否则，执行步骤s8，即结束本流程。
59.其中，记目标图像的清晰度评分为s，若s≥s0，则不需要执行重新调焦过程；若s＜s0，则需要执行重新调焦过程。
60.s7、对物镜执行重新调焦过程，以重新确定目标位置；其中，重新调焦过程包括初始调焦过程的全部或部分步骤。
61.步骤s7中，若s＜s0，对物镜执行重新调焦过程，包括：
62.若清晰度评分小于评分阈值且大于细调焦理想评分，即sc＜s＜s0，控制物镜从当前位置向上移动第三距离(x3微米)，并执行细调焦步骤；
63.若清晰度评分小于或等于细调焦理想评分，且大于中调焦理想评分，即sb＜s≤sc，控制物镜从当前位置向上移动第二距离(x2微米)，并执行中调焦步骤和细调焦步骤；
64.若清晰度评分小于或等于中调焦理想评分，即s≤sb，控制物镜从当前位置向上移动第一距离(x1毫米)，执行粗调焦过程、中调焦步骤和细调焦步骤。
65.本发明实施例中，x1、x2、x3、y1、y2、y3分别取自0-20的数值。
66.s8、不需要执行重新调焦过程。
67.实施本发明实施例，采用软件算法识别为主、z轴电机调节工作距离为辅的软硬件结合的方式，成本低，识别准确，灵活度高，可适用于不同厚度的盖玻片(flow cell)，适用不同发光效率的染料、不同大小的磁珠，甚至可因场合制宜的设计识别算法，因此可以适用不同的应用场合，无需改变硬件。由于是通过图像清晰度评分对比来获取最佳拍摄位置的方式，使得环境光的干扰、染料的差异、仪器长期运行产生的器件性能变化等因素都不会影响最终的结果，都能自动的、准确的找到最清晰的焦平面。
68.如图3所示，本发明实施例公开一种测序仪成像对焦装置，包括初始调焦单元301、拍摄单元302、确定单元303、划分单元304、评分单元305和重新调焦单元306；其中，
69.初始调焦单元301，用于对测序仪的物镜执行初始调焦过程，以确定目标位置；
70.拍摄单元302，用于控制物镜在目标位置对测序样品进行拍摄，获得目标图像；
71.确定单元303，用于确定目标图像中的多个荧光样品点；
72.划分单元304，用于将多个荧光样品点划分为清晰样品点、模糊样品点和错误样品点；
73.评分单元305，用于将清晰样品点数量、模糊样品点数量、错误样品点数量、各个荧光样品点的灰度值和边长作为输入数据，输入至预先构建好的清晰度评分模型，得到目标图像的清晰度评分；
74.重新调焦单元306，用于在目标图像的清晰度评分小于评分阈值时，触发初始调焦单元301对物镜执行重新调焦过程，以重新确定目标位置，直至目标图像的清晰度评分大于或等于评分阈值；其中，重新调焦过程包括初始调焦过程的全部或部分步骤。
75.在一些实施例中，上述确定单元303可以包括以下未图示的子单元：
76.计算子单元，用于计算目标图像的每一个像素点的灰度值；
77.确定子单元，用于将灰度值达到灰度阈值的像素点确定为荧光像素点；
78.判断子单元，用于判断以荧光像素点为中心的九宫格域内的荧光像素点数量是否至少为二；在遍历目标图像的各个荧光像素点之后，获得多个荧光样品点；
79.判定子单元，用于在判断子单元判断出荧光像素点为中心的九宫格域内的荧光像素点数量至少为二时，判定九宫格域内的所有荧光像素点连续，且属于同一个荧光样品点；否则，判定荧光像素点为荧光样品点的边界点。
80.在一些实施例中，上述划分单元304可以包括以下未图示的子单元：
81.投影子单元，用于将各个荧光样品点投影到x轴和y轴，获得各个荧光样品点的投影数据；
82.边长确定子单元，用于根据投影数据，确定出荧光像素点最多的一边的荧光像素点数量作为荧光样品点的边长；
83.划分子单元，用于在任一荧光样品点的边长小于或等于清晰阈值时，判定该荧光样品点为清晰样品点；以及，在任一荧光样品点的边长大于清晰阈值，且小于或等于模糊阈值时，判定该荧光样品点为模糊样品点；以及，在任一荧光样品点的边长大于模糊阈值时，
判定该荧光样品点为错误样品点。
84.在一些实施例中，上述初始调焦单元301可以包括以下未图示的子单元：
85.粗调焦子单元，用于执行粗调焦步骤；具体地，确定物镜满足理论工作距离的理论位置，从位于理论位置上方的第一起点开始，控制物镜以第一指定步长每向下移动一次，拍摄获得一个样品图像，并对样品图像进行清晰度评分，直至样品图像的清晰度评分与粗调焦理想评分的接近度量值满足预设条件；根据粗调焦过程获得的多个样品图像的清晰度评分，确定出粗调焦过程最高分时物镜的第一位置；其中，第一起点与理论位置的距离为第一距离；
86.中调焦子单元，用于执行中调焦步骤；具体地，从位于第一位置上方的第二起点开始，控制物镜以第二指定步长每向下移动一次，拍摄获得一个样品图像，并对样品图像进行清晰度评分，直至样品图像的清晰度评分与中调焦理想评分的接近度量值满足预设条件；根据中调焦过程获得的多个样品图像的清晰度评分，确定出中调焦过程最高分时物镜的第二位置；其中，第二指定步长小于第一指定步长，第二起点与第一位置的距离为第二距离，第二距离小于第一距离；
87.细调焦子单元，用于执行细调焦步骤；具体地，从位于第二位置上方的第三起点开始，控制物镜以第三指定步长每向下移动一次，拍摄获得一个样品图像，并对样品图像进行清晰度评分，直至样品图像的清晰度评分与细调焦理想评分的接近度量值满足预设条件；根据细调焦过程获得的多个样品图像的清晰度评分，确定出细调焦过程最高分时物镜的第三位置；将第三位置确定为目标位置；其中，第三指定步长小于第二指定步长，第三起点与第二位置的距离为第三距离，第三距离小于第二距离。
88.在一些实施例中，上述重新调焦单元306，用于在目标图像的清晰度评分小于评分阈值时，触发初始调焦单元301对物镜执行重新调焦过程，即触发初始调焦单元301执行全部或部分步骤的方式具体是：
89.上述重新调焦单元306，用于在目标图像的清晰度评分小于评分阈值，且大于细调焦理想评分时，控制物镜从当前位置向上移动第三距离，并触发细调焦子单元执行细调焦步骤；以及，
90.在目标图像的清晰度评分小于或等于细调焦理想评分，且大于中调焦理想评分时，控制物镜从当前位置向上移动第二距离，并触发中调焦子单元执行中调焦步骤和细调焦子单元执行细调焦步骤；以及，
91.在目标图像的清晰度评分小于或等于中调焦理想评分时，控制物镜从当前位置向上移动第一距离，并触发粗调焦子单元执行粗调焦步骤、中调焦子单元执行中调焦步骤和细调焦子单元执行细调焦步骤。
92.在一些实施例中，本测序仪成像对焦装置还包括阈值确定单元，用于在粗调焦子单元执行粗调焦步骤、中调焦子单元执行中调焦步骤和细调焦子单元执行细调焦步骤之后，根据粗调焦、中调焦和细调焦三个过程获得的多个样品图像的清晰度评分，确定评分阈值。
93.进一步地，上述阈值确定单元，可以具体用于根据粗调焦、中调焦和细调焦三个过程获得的多个样品图像的清晰度评分，确定出清晰度最低分作为评分阈值；或者，根据粗调焦、中调焦和细调焦三个过程获得的多个样品图像的清晰度评分，确定出清晰度平均分作
为评分阈值；或者，根据粗调焦、中调焦和细调焦三个过程获得的多个样品图像的清晰度评分，确定出清晰度最高分；将清晰度最高分与指定系数的乘积作为评分阈值，指定系数小于一。
94.如图4所示，本发明实施例公开一种电子设备，包括存储有可执行程序代码的存储器401以及与存储器401耦合的处理器402；
95.其中，处理器402调用存储器401中存储的可执行程序代码，执行上述各实施例中描述的测序仪成像对焦方法。
96.本发明实施例还公开一种计算机可读存储介质，其存储计算机程序，其中，该计算机程序使得计算机执行上述各实施例中描述的测序仪成像对焦方法。
97.以上实施例的目的，是对本发明的技术方案进行示例性的再现与推导，并以此完整的描述本发明的技术方案、目的及效果，其目的是使公众对本发明的公开内容的理解更加透彻、全面，并不以此限定本发明的保护范围。
98.以上实施例也并非是基于本发明的穷尽性列举，在此之外，还可以存在多个未列出的其他实施方式。在不违反本发明构思的基础上所作的任何替换与改进，均属本发明的保护范围。