一种桑葚单体化合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物提取技术领域，更具体地说，本发明涉及一种桑葚单体化合物及 其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 炎症是由致病菌、有害刺激或物理损伤引起的适应性反应，是机体对感染或组织 损伤所产生的一种防御措施。在炎症发生初期，这种防御机制是有益的，炎性细胞释放出 相应的炎症因子，对损伤因子进行一系列的防御反应，如稀释和杀伤等，与此同时，所释放 出的炎症因子参与机体损伤部位的修复和愈合；而在炎症反应过于剧烈或持久时，机体 有益的炎症就会发生改变，并反过来诱发各种炎症相关疾病，甚至演变成慢性或持久性疾 病。由慢性炎症反应产生的大量炎症介质被证实参与了许多疾病的病理过程，包括心血管 疾病、类风湿性关节炎、癌症、红斑狼疮、糖尿病和强直性颈椎炎等。有许多因素都能诱发 炎症，如感染、物理化学损伤刺激、毒素等，其中病原微生物感染是最常见的一类，如脂多 糖（lipopolysaccharides，LPS)。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分之一，只有在细 菌进行繁殖或死亡时才被释放出来，其致炎性极强。当受到革兰氏阴性菌感染使机体受到 损伤时，大量的LPS被释放出来，随后与细胞膜上的Toll样受体4(Tolllikereceptor 4,TLR4)结合，进而与宿主细胞相互作用，通过细胞内信号通路的传递将刺激信号级联放 大，最终引起一系列的炎症反应。LPS刺激机体后导致大量的生物活性因子的合成和释放， 诸如：前列腺素（prostaglandin,PGs)、一氧化氮（nitricoxide,NO)等炎症介质，以及白 介素 _1P(interleukin-1 0，IL-1 0 )、白介素-6 (interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子 a(tumornecrosisfactora,TNF-a)等炎性细胞因子，使机体表现出多种炎症反应，严 重时可引起全身炎症反应综合征（systemicinflammatoryresponsesyndrome,SIRS)、 脓毒性休克、多器官衰竭（multipleorganfailure，M0F)甚至死亡。异常表达的炎性 细胞因子（IL-1P，IL-6,TNF-a等）、环氧合酶-2 (Cyclooxygenase-2,C0X-2)及核因 子-KB(Nuclearfactor-KB,NF-KB)是分子水平上炎症癌变的诱因。因此，想要更好的 预防或者治疗炎症引发的相关疾病，就需要抑制炎症介质的生成或阻断其生物学功能，而 筛选抗炎活性物质及研究其作用机理，则可以成为开发新的预防和治疗癌症的重要手段。
[0003] 功能性油脂是指具有一定特殊生理功能的油脂，尽管目前对功能性油脂还没有很 权威的定义，但是功能油脂被非官方的归类为功能食品的一个子集，它们常常被用于作为 传统饮食以外的补充剂，但是它们拥有超出基础营养功能的优点，具有很好的生理效益及 降低慢性疾病的风险，如预防肥胖、降血脂、预防老年痴呆等作用。
[0004] 功能性油脂主要涉及以下几种：（1) ?-3脂肪酸：包括a-亚麻酸 (alpha-linolenicacid,ALA)、二十碳五稀酉爱（eicosapentaenoicacid,EPA)和二十二碳 六稀酸（docosahexaenoicacid,DHA)，（2) ?-6 脂肪酸：包括y-亚麻酸（gammaIinolenic acid,GLA)和亚油酸（linoleicacid,LA)，（3)共辄亚油酸（conjugatedIinoleic acid，CLA)，（4)中链甘油三酯（mediumchaintriglyceride，MCTs)和（6)植物留醇 (phytosterols)〇
[0005] 哺乳动物无法自行合成w-3及《-6多不饱和脂肪酸（polyunsaturatedfatty acids，PUFAs)，必需从食物中摄取。这些PUFAs是细胞膜的重要组成成分。饮食中脂肪酸的 含量会影响正常和肿瘤组织的细胞膜脂肪酸组成，这可能会影响膜的属性，如渗透率或脂 质包装、基因表达、转录因子活性、蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)等特定蛋白质的活 性及信号转导。大量研究表明co-3脂肪酸和GLA可用于预防和治疗众多的疾病，如痤疮、 异位性湿疹、银肩病、心血管疾病、过敏性皮炎等。
[0006] 桑葚（mulberry)作为能滋阴补血、生津润燥的药食同源类食品，含有很多活性 物，包括除了黄酮醇、花色苷、酚酸、氨基酸外，还有大量的微量元素及矿物质。桑葚作为药 用始载于唐《新修本草》，其功效在许多中药著作中都有记载，如《本草纲目》、《本草拾遗》、 《随息居饮食谱》等。桑叶、桑根皮和桑枝在传统中医中被用于治疗发热、护肝、明目、利尿和 降血压等。还有研究表明桑果、桑根皮和桑枝皮被广泛用于治疗黄疸、肝炎、癌症、糖尿病、 腹泻、高血压等。早在1993年桑葚已成为享有"既是食品又是药品"这一美称的农产品，具 有很高的食用和药用价值，是开发功能性食品的优质原料。
[0007] 桑树的提取物，最常见是以桑叶为材料进行提取为多，桑叶有效成分提取物的研 究报道及专利申请已非常多，而利用果实桑葚作为材料的不多，目前尚未有桑葚二氯甲烷 提取物中抗炎有效成分提取或桑葚单体化合物的研究报道。
【发明内容】
[0008]有鉴于此，为了克服上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种桑葚单体化 合物及其制备方法和应用。
[0009] 为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
[0010] -种桑葚单体化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0011] (1)、将新鲜的桑葚搅碎，常温常压下用盐酸酸化的乙醇萃取过夜，收集上清萃取 液，重复该步骤2~3次，减压回收乙醇，浓缩萃取液，旋转蒸干至质量不再改变，得到桑葚 粗提物；将桑葚粗提物溶于水中，再加入等体积的水饱和二氯甲烷进行萃取，收集下层二氯 甲烷萃取液，重复该步骤2~3次，减压回收二氯甲烷，浓缩萃取液，旋转蒸干至质量不再改 变，得到桑葚二氯甲烷提取物；
[0012](2)、将桑葚二氯甲烷提取物上大孔树脂柱，用3倍柱保留体积的环己烷-乙酸乙 酯的混合溶剂进行系统梯度洗脱，梯度洗脱结束后，用甲醇洗脱至洗脱液无色，收集洗脱 液，经硅胶柱层析和TLC分析后，得到糖类、脂肪酸和酯类化合物的混合物；
[0013] (3)、将部分洗脱下来的酯类化合物的混合物进行羟丙基葡聚糖凝胶柱层析，用等 浓度氯仿-甲醇的混合溶剂洗脱得到酯类化合物的有效部分，随后进行反相硅胶柱层析， 用甲醇溶液进行梯度洗脱，浓缩得到浓缩物；再进行正相硅胶柱层析，用含1%乙酸的体积 比为97:3的环己烷-丙酮的混合溶剂进行等浓度洗脱，得到化合物的富集物，随后对该富 集物采用高效液相色谱设备，在甲醇-水体系中进行纯化，即可得到亚麻酸乙酯的高纯度 单体化合物；
[0014] (4)、将步骤（2)洗脱下来的脂肪酸类化合物的混合物进行反相硅胶柱层析，用甲 醇溶液进行梯度洗脱，浓缩得到化合物的富集物，随后对该富集物采用高效液相色谱设备， 在甲醇-水体系中进行纯化，即可得到亚油酸的高纯度单体化合物。
[0015] 在其中一些实施例中，步骤（2)中所述混合溶剂中环己烷与乙酸乙酯的体积比依 次为：100:0、99 :1、98:2、97:3、96:4、95:5、9 :1、8:2、7:3、6:4 和 0:100,梯度洗脱的温度为 25±5°C，洗脱压力为lOOKPa。
[0016] 在其中一些实施例中，步骤（3)中所述甲醇溶液中甲醇与水的体积比依次为8:2 和10:0,梯度洗脱的温度为25±5°C，洗脱压力为IOOKPa;HPLC的制备参数为：0-40min， 90-100% ;40-45min，100-100% ;45-50min，90-90%。
[0017] 在其中一些实施例中，步骤（4)中所述甲醇溶液中甲醇与水的体积比依次为8:2 和10:0,梯度洗脱的温度为25±5°C，洗脱压力为IOOKPa;HPLC的制备参数为：0-30min， 80-100% ;30-35min，100-100% ;35-40min，80-80%。
[0018] 在其中一些实施例中，步骤（2)中所述大孔树脂的孔径为200-300目。
[0019] 在其中一些实施例中，步骤（2)中所述羟丙基葡聚糖凝胶为SephadexLH-20分子 筛树脂。
[0020] 在其中一些实施例中，步骤（2)和（3)中所述反向硅胶为75C18-0PN反向硅胶。
[0021] 在其中一些实施例中，步骤（2)中所述正向硅胶的孔径为300-400目。
[0022] 在其中一些实施例中，步骤（1)中所述盐酸酸化的乙醇为0. 1 %的盐酸酸化的 80%乙醇。
[0023] 在其中一些实施例中，步骤（1)中所述盐酸酸化的乙醇的制备方法为：先配制终 浓度为80 %的乙醇溶液，再用盐酸酸化，使得盐酸终浓度为0. 1 %。
[0024] 在其中一些实施例中，步骤（1)中所述萃取条件为：萃取温度为25±5°C，萃取压 力为lOOKPa。
[0025] 在其中一些实施例中，步骤（1)中所述旋转蒸干的温度为50±5°C。
[0026] 本发明还提供了上述制备方法制备得到的桑葚单体化合物。
[0027] 本发明还提供了上述桑葚单体化合物在制备预防肠炎的保健品中的应用。
[0028] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0029] 本发明采用酸化乙醇法及有机溶剂萃取法从桑葚中提取而得桑葚二氯甲烷提取 物，并利用柱层析和高效液相色谱设备，进一步制备得到相应的桑葚单体化合物。经实验研 究表明，提取出来的两个桑葚单体化合物均属于功能油脂，在细胞水平上具有显著的抗炎 活性。本发明所提供的桑葚单体化合物的制备方法简单，适合大规模工业化生产，有望开 发成新的抗炎保健品。
【附图说明】
[0030] 图1为本发明实施例1中桑葚单体化合物的制备方法流程图，其中 MB-El-B2-dl-