锌铜超氧化物歧化酶sod1表达量的分子检测方法及引物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测领域，涉及一种体外基因分子诊断方法，尤其是一种锌铜超 氧化物歧化酶SODl表达量的分子检测方法及所用的引物。 技术背景
[0002] 超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase简称S0D)是一种新型酶制剂。它在生 物界的分布极广，几乎从动物到植物，甚至从人到单细胞生物，都有它的存在。SOD被视为生 命科技中最具神奇魔力的酶，是人体内的垃圾清道夫，S0D是氧自由基的自然天敌，是机体 内氧自由基的头号杀手，是生命健康之本。
[0003] 由于现代生活压力、环境污染、各种辐射以及超量运动等都会造成氧自由基大量 形成，现已证实，氧自由基可引发的疾病多达60多种。SOD在生物体内的水平高低意味着衰 老与死亡的直观指标，它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细 胞，修复基因自由基造成的对细胞伤害。因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要。
[0004] SODl是SOD家族中的一种，基本上所有的真核细胞的细胞内都含有带有铜和锌的 超氧化物歧化酶，是一种可溶性蛋白，主要存在于细胞质中。目前体外的SOD的检测方法主 要集中在蛋白质与蛋白质互作的elisa法和酶竞争法，此方法可以检测酶的活性，但是由 于样品蛋白质人为操作因素导致误差大，且蛋白质不稳定，极易降解和变性，导致活性下降 和失活，结果的可信度大打折扣。
[0005] CN102095856A公开了一种超氧化物歧化酶快速检测卡及其检测方法，在长条扁平 薄壳状的检测卡外壳中设置测试条，检测卡外壳表面有检测窗孔和加样孔；测试条是由支 承背板上通过不干胶在其上依次粘贴样品垫、胶体金膜、硝酸纤维素膜、和吸水膜所组成； 支承背板中部叠置粘贴硝酸纤维素膜，支承背板一端叠置粘贴吸水膜，另一端叠置粘贴样 品垫，吸水膜内端与样品垫内端各自分别与硝酸纤维素膜搭接，在样品垫与硝酸纤维素膜 的搭接部，两者之间夹置粘贴一段胶体金膜；胶体金膜为含抗超氧化物歧化酶抗体胶体金 标记的玻璃纤维膜，硝酸纤维素膜上有一条检测带和一条质控带，依次是：含超氧化物歧化 酶的检测带，含抗兔抗体或抗鼠抗体的质控带，测试条置入检测卡外壳内，样品垫正对加样 孔，硝酸纤维素膜正对检测窗孔。
[0006] 目前市场还尚未发现有关SODl的分子水平检测试剂盒，本发明对未来分子检测 SOD提供了强有力的基础。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种人体内锌铜超氧化物歧化 酶SODl表达量的体外分子检测方法及所用的引物，本方法可以在体外检测人体不同组织、 细胞受到的氧化损伤程度的相对大小，可应用于体外基因分子诊断等方面。
[0008] 本法实现目的的技术方案如下：
[0009] -种锌铜超氧化物歧化酶SODl表达量的分子检测用引物，
[0010] 正向引物序列：CAGAAGGAAAGTAATGGACCAGTGA ;
[0011] 反向引物序列：AGTCTCCAACATGCCTCTCTTCATC。
[0012] 与锌铜超氧化物歧化酶SODl表达量的分子检测用引物配合使用的内参基因 GADPH引物，内参基因的正向引物序列：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT
[0013] 内参基因的反向引物序列：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。
[0014] -种锌铜超氧化物歧化酶SODl表达量的分子检测方法，方法如下：
[0015] ⑴目标组织或细胞中总RNA的提取：
[0016] ⑵采用步骤⑴提取出的RNA进行逆转录PCR，获得模板RNA ;
[0017] ⑶采用权利要求1所述的引物和权利要求1所述的内参基因 GADPH，以及步骤⑵的 模板RNA进行实时荧光定量PCR。
[0018] 本发明的优点和积极效果：
[0019] 本发明提供一种锌铜超氧化物歧化酶SODl表达量的分子检测方法，首次用qPCR 的方法，以基因水平的检测来鉴定SODl的含量，同时提供一套有针对性引物序列和内参序 列，即使在样品提取的RNA中有DNA污染的情况下，也可以稳定、特异、准确的检测出人的不 同组织、细胞中SODl基因的表达量差异，且有极高的重复性，克服了市场上常用酶活检测 试剂盒的人为因素影响大、稳定性差、重复性差等因素。
[0020] 本发明可以应用在医疗检测和化妆品抗衰老领域，配合大量临床实验数据的基础 上，可以早期判断由于SODl酶表达量高低反映相关疾病的情况，对疾病的早期治疗和预防 起到积极的作用，目前市场上还未出现关于SOD的分子检测产品，有利于推动SOD分子检测 市场的发展。
【附图说明】
[0021] 图1为本发明引物特异性：5种不同浓度双氧水处理人皮肤细胞后SODl与GADPH 熔解曲线图；
[0022] 图2为本发明qPCR反应性灵敏性：5种不同浓度双氧水处理人皮肤细胞后的SODl 的扩增曲线图，双氧水浓度为（μΜ) :0、200、400、800、1000;
[0023] 图3为本发明GAPDH、SODl扩增基因琼脂糖凝胶电泳图，从左至右依次为： maker (从上至下依次为 700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、100bp)、GADPH(185bp)、 sodl(187bp)；
[0024] 图4为本发明结果分析5种不同浓度双氧水处理人皮肤细胞后的SODl表达量差 异柱状图。
[0025] 图5为标准曲线，横坐标为拷贝数Ig值，众坐标为Cq值。
[0026] 具体的实施方式
[0027] 为了理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明：下述实施例是说明性 的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0028] 本方法中荧光定量PCR引物的正反向引物均是跨基因组内含子设计，避免了由于 样品中残留的基因组DNA的污染，而导致结果的准确度低和重复性差的缺点，提高了特异 性和结果的准确度。使用NCBI blast比较，与使用PMMER5. 0设计软件分析，优化引物， 将发各项指征均控制在最优范围之内，极大程度降低了引物二聚体的形成。将引物长度 达到较高的25bp，在一定程度上也提高了扩增的特异性。无需加入DNase处理，同时采用 sybergreen法，同探针法相比节省了一定的成本。RNA序列号NM_000454. 4 GI: 48762945
[0029] -种锌铜超氧化物歧化酶SODl表达量的分子检测方法及所用的引物，以下方法 以人皮肤细胞为例子，来说明具体的检测方法。本发明以5种不同浓度双氧水处理人皮肤 细胞后SODl检测为例来说明所使用引物的特异性，具体操作过程如下：